色譜分析技術
高壓液相色譜
Martin 和 Synge在1941年就提出高效相色譜的設想，然而直到六十年代后期，由于各種技術的發(fā)展，高效液相色譜才付諸實現(xiàn)。這種色譜技術曾被稱為高速液相色譜（HighSpeed Liquid Chromatography），高壓液相色譜（High Parss-ure Lipuid Chromatography），目前使用最多的名稱是高效液相色譜（High Pe-rformance Liauid Chromatography，HPLC）。高效液相色譜已經(jīng)廣泛地應用，成為一項不可缺少的技術。它的主要優(yōu)點是⑴分辯率高于其它色譜法；⑵速度快，十幾分鐘到幾十分鐘可完成；⑶重復性高；⑷高效相色譜柱可反復使用；⑸自動化操作，分析精確度高。根據(jù)分離過程中溶質分子與固定相相互作用的差別，高效液相色譜可分為四個基本類型，即液－固色譜、液－液色譜、離子交換色譜和體積排阻色譜。高效液相色譜在生物領域中廣泛用于下列產(chǎn)物的分離和鑒定：⑴氨基酸及其衍生物；⑵有機酸；⑶甾體化合物；⑷生物鹼；⑸抗菌素；⑹糖類；⑺卟啉；⑻核酸及其降解產(chǎn)物；⑼蛋白質、酶和多肽；⑽脂類等。 
一、分類
　　高效液相色譜法可分為四個基本類型：即液－固色譜法，鍵合相色譜法，離子交換色譜法及體積排阻色譜法。
（一）液－固色譜法
　　液－固色譜法通常稱吸附色譜法，吸附劑有活性碳，氧化鋁和硅膠，在液－固色譜法中用的載體都是硅膠。硅膠對溶質，分子的吸附能力不是平均分布在整個硅脫表面的，在硅膠表面有一些區(qū)域與溶質分子強烈相互作用，這些區(qū)域為活性位置，硅膠與溶質分子間主要作用是偶極距力氫鍵及靜電相互作用。極性越強，而化合物在硅膠柱上的滯留時間也長。在液－固色譜中，依靠流動相溶劑分子與溶質分子競爭固定相互活性位置， 從而使溶質從色譜柱上洗脫下來。與硅膠表面活性位置結合力強的溶劑洗脫溶質分子的能力強，因而稱強溶劑，反之為弱溶劑。液─固色譜法的特點是適于分離色譜幾何異構體，可用于脂溶性化合物質如磷脂，甾體化合物，脂溶性維生素，前列腺素等。
（二）鍵合相色譜法
　　鍵合相色譜法是由液－液色譜法即分配色譜發(fā)展起來的。鍵合相色譜法將固定相共價結合在載體顆粒上，克服了分配色譜中由于固定相在流動中有微量溶解，及流動相通過色譜柱時的機械沖擊，固定相不斷損失，色譜柱的性質逐漸改變等缺點。鍵合相色譜法可分為正常相色譜法和反相色譜法。
1.正常相色譜法
　　在正常相色譜法中共價結合到載體上的基團都是極性基團，如一級氨基、氰基、二醇基、二甲氨基和二氨基等。流動相溶劑是與吸附色譜中的流動相很相似的非極性溶劑，如、已烷及等。由于固定相是極性，因此流動溶劑的極性越強，洗脫能力也越強，即極性大的溶劑是強溶劑。固定相與流動相的這種關系正好與液－固色譜法相同，稱這種色譜法為正常相色譜法。盡管如此，正常相色譜法的分離原理主要根據(jù)化合物在固定相及流動相中分配系數(shù)的不同進行分離，它不適于分離幾何異構體。
2.反相色譜法
　　在反相色譜法中共價結合到載體上的固定相是一些直鏈碳氫化合物，如正辛基等。流動相的極性比固定相的極性強。反相色譜法在高效液相色譜法中應用最廣泛。 在反相色譜法中，使溶質滯留的主要作用是疏水作用，在高效液相色譜中又被稱為疏溶劑作用。所謂疏水作用即當水中存在非極性溶質時，溶質分子之間的相互作用 、溶質分子與水分子之間的相互作用遠小于水分子之間的相互作用， 因此溶質分子從水中被“擠”了出去�？梢姺聪嗌�譜中疏水性越強的化合物越容易從流動相中擠出去，在色譜柱中滯留時間也長，所以反相色譜法中不同的化合物根據(jù)它們的疏水特性得到分離。反相色譜法適于分離帶有不同疏水基團的化合物，亦即非極性基團的化合物。此外，反相色譜法可用于分離帶有不同極性基團的化合物�？梢酝ㄟ^改變流動相的溶劑及其組成和pH，以影響溶質分子與流動相的相互作用，改變它們的滯留行為。另外，反相色譜中水的流動相中占的比例伸縮性很大，可以／從0-100％，從而使反相色譜可用于水溶性、脂溶性化合物的分離。反相色譜法中的固定相是被共價結合到硅膠載體上的直鏈飽和和烷烴，其鏈的長短不同，最長的是十八烷基，這也是使用得最多的固定相。直鏈飽和烷烴疏水特性隨著碳氫鏈的長度而增加，在反相色譜柱中溶質由于疏水作用而滯留的時間也將隨著碳氫鏈的長度而增加。在一般情況下這意味著用碳氫鏈長的反相色譜柱能得到較好的分辯率，在多數(shù)情況下是依靠反復來選擇色譜柱。由于反相色譜法的固定相是疏水的碳氫化合物，溶質與固定相之間的作用主要是非極性相互作用，或者說疏水相互作用，因此溶劑的強度隨著極性降低而增加。水是極性最強的溶劑，也是反相色譜中最弱的溶劑。在反相色譜中常常用和基礎溶劑，向其中加入不同濃度的、可以與水混溶的有機溶劑，以得到不同強度的流動相，這些有機溶劑稱為修飾劑。反相色譜中最常用的有機溶劑有甲醇和乙腈
    在生化分析中，反相色譜的應用極廣�？捎糜冖侔被�酸和多肽的分析；②蛋白質的分離；③堿基，核酸和核酸酶的分析；④甾體化合物的分析；⑤以及其他如幾茶酚胺類，組胺，糖及維生素的分離。
（三）離子交換色譜
　　離子交換色譜中的固定相是一些帶電荷的基團， 這些帶電基團通過靜電相互作用與帶相反電荷的離子結合。如果流動相中存在其他帶相反電荷的離子，按照質量作用定律，這些離子將與結合在固定相上的反離子進行交換。固定相基團帶正電荷的時候，其可交換離子為陰離子，這種離子交換劑為陰離子交換劑；固定相的帶電基團帶負電荷，可用來與流動相交換的離子就是陽離子，這種離子交換劑叫做陽離子交換劑。陰離子交換柱的功能團主要是－NH₂，及－MH³⁺ ：陽離子交換劑的功能團主要是－SO₃H及－COOH。其中-NH³⁺離子交換柱及-SO₃H離子交換劑屬于強離子交換劑，它們在很廣泛的pH范圍內都有離子交換能力；-NH₂及-COOH 離子交換柱屬于弱離子交換劑，只有在一定的pH值范圍內，才能有離子交換能力。離子交換色譜主要用于可電離化合物的分離，例如，氨基酸自動分析儀中的色譜柱，多肽的分離、蛋白質的分離，核苷酸、核苷和各種堿基的分離等。
二、易出現(xiàn)的問題
（一）渦流擴散（Eddy diffusion）
　　流動相碰到較大的固體顆粒，就像流水碰到石頭一樣產(chǎn)生渦流。如果柱裝填得不均勻，有的部分松散或有細溝，則流動相的速度就快；有的部位結塊或裝直緊密則流就慢，多條流路有快有慢，就使區(qū)帶變寬。因此，固相載體的顆粒要小而均勻，裝柱要松緊均一，這樣渦流擴散小，柱效率高。
（二）分子擴散（Molecular diffusion）
　　分子擴散就是物質分子由濃度高的區(qū)域向濃度低的區(qū)域運動，也稱縱向分子擴散。要減少分子擴散就要采用小而均勻的固相顆粒裝柱。同時在操作時，如果流速太慢，被分離物質停留時間長，則擴散嚴重。
（三）質量轉移（Mass transfer）
　　被分離物質要在流動相與固定相中平衡，這樣才能形成較窄的區(qū)帶。在液相色譜中，溶質分子要在兩個液相之間進行分配，或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的時間。當流速快時，轉移速度慢，來不及達到平衡動相就向前移，這各物質的非平衡移動，使區(qū)帶變寬。
（四）動相流速
　　當流速太低時，分子擴散嚴重，特別是在氣相色譜中尤為突出。如將理論塔板高度對流速作圖，理論塔板高度隨流速增加而急速下降，當達到最低值時，流速再加大則質量轉移起主要作用，理論塔板高度又加大。在高效液相色譜中，流速稍快影響不大，但在凝膠過濾色譜中，因為物質要滲透到凝膠內部，所以質量轉移影響大，流速咖大會降低柱效率。
（五）固定相顆粒大小
　　定相顆粒越小柱效率越高，對流動相流動的阻力越大，需要加大壓力才能使它流動。
 
親和色譜法

• 基本理論

（一）原理：在生物體內，許多大分子AKSJDHFKLSDFHKLSDJ具有與某些相對應的專一分子可逆結合的特性。例如抗原和抗體、酶和底物及輔酶、激素和受體、RNA和其互補的DNA等，都具有這種特性。生物分子之間這種特異的結合能力稱為親和力，根據(jù)生物分子間親和吸附和解離的原理，建立起來的色譜法稱親色譜法。親和色譜中兩個進行專一結合的分子互稱對方為配基。如抗原和抗體，抗原可認為是抗體的配基，反之抗體也可認為是抗原的配基。將一個水溶性配基在不傷害其生物學功能的情況下與水不溶性載體結合稱為配基的固相化。親和色譜法的基本過程是： 1.配基固相化。將與純化對象有專一結合作用的物質，連接在水不溶性載體上，制成親和吸附劑后裝柱（稱親和性）。 2.親和吸附。將含有純化對象的混合物通過親和柱，純化對象吸附在柱上，其他物質流出色譜柱。 3.解吸附。用某種緩沖液或溶液通過親和柱，把吸附在親和柱上的欲純化物質洗脫出來。
（二）應用范圍親和色譜可用于下列生物體系：酶：底物、抑制劑、輔酶抗體：抗原、病毒、細胞外源凝集素：多糖、糖蛋白、細胞表面受體、細胞核酸：互補堿基序列、組蛋白、核酸聚合酶 、結合蛋白激素及維生素：受體、載體蛋白細胞：細胞表面特異蛋白、外源凝集素親和色譜的優(yōu)點是操作簡便、效率高、條件溫和，缺點是使用局限性大。 
（三）載體的選擇原則用于親和色譜的理想載體應具有下列特性：⑴不溶性：不溶于水；⑵滲透性：疏松網(wǎng)狀結構，容許大分子自由通過；⑶有一定硬度，最好為均一的珠狀；⑷具有大量可供反應的化學基團，能與大量配基共價連接；⑸非特異性吸附能力極低；⑹能抗微生物和酶的侵蝕；⑺有較好的化學穩(wěn)定性；⑻親水性。選擇配基根據(jù)對純化大分子的特異性的全面認識。選擇也的配基有兩條標準：第一是蛋白質和配基之間必須有強的親和力，解離常數(shù)在5mM以上不是好配基； 相反親和力太高也是有害的，因為在解離蛋白質──配基復合物時所需的條件就要強烈，這樣可能使蛋白質變性。例如用抗生物素蛋白作配基純化含生物素的羧化酶時，生物素──抗生物素蛋白復合物的解離常數(shù)達10-15M，解離時需要pH1.5，6M鹽酸胍，在這種條件中。羧化酶大多數(shù)已經(jīng)變性。選擇配基的第二個標準是，配基必須具有適當?shù)幕瘜W基團，這種基團不參與配基與蛋白質之間特異結合，但可用于活化和載體相連接，同時又不影響配基與蛋白質之間的親和力。
（四）常見載體的特性瓊脂糖凝膠： 親水性強，理化性質穩(wěn)定 （商品名：Sepharose） 聚凝膠： 理化性質穩(wěn)定，耐有機溶劑及去污劑， 抗微生物能力強， 特別適應用配基與提取物親和力比較弱的物質。葡聚糖凝膠： 有良好的化學及物理性質，孔經(jīng)小。 纖維素： 非特易吸附嚴重，廉價，易得。
 
 二、實驗方法　　親和色譜分離的方法隨每種分離物質的不同而有不同。一般推薦使用的程序如下： 1選擇配基；2選擇偶聯(lián)凝膠；3偶聯(lián)配基；4裝填合適的柱；5平衡（2-3倍體積緩沖液）；6應用樣品；7洗滌未結合物質；8洗脫結合物質→除鹽；9再生　　
 
吸附色譜法
吸附色譜法常叫做液－固色譜法（Liquid-Solid Chromatography，簡稱LSC），它是基于在溶質和用作固定固體吸附劑上的固定活性位點之間的相互作用�？梢詫⑽�附劑裝填于柱中、覆蓋于板上、或浸漬于多孔濾紙中。吸附劑是具有大表面積的活性多孔固體，例如硅膠、氧化鋁和活性炭等�；钚渣c位例如硅膠的表面醇，一般與待分離化合物的極性官能團相互作用。分子的非極性部分（例如烴）對分離只有較小影響，所以液－固色譜法十分適于分離不同種類的化合物（例如，分離醇類與芳香烴）。