法。目前，常用的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法主要分為三類途徑：物理介導(dǎo)（電穿孔法，基因槍法、顯微注射法）、化學(xué)介導(dǎo)（脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣共沉淀法、陽(yáng)離子聚合物介導(dǎo)法）、生物介導(dǎo)（病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染）。

理想細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)。目前實(shí)驗(yàn)室常用的轉(zhuǎn)染方法有脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，陽(yáng)離子聚合物轉(zhuǎn)染和病毒轉(zhuǎn)染，不同的轉(zhuǎn)染方法各有利弊，針對(duì)細(xì)胞的習(xí)性和不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康目蛇x擇相對(duì)合適的轉(zhuǎn)染方法。

一般來(lái)說，原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染難度是比較大的，雖然眾所周知，原代細(xì)胞研究具有非常重要的生物學(xué)意義，但是轉(zhuǎn)染效率低下一直是制約其發(fā)展的主要因素。

本文我們主要介紹一種常用的適用于原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方法：脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法。

---陽(yáng)離子脂質(zhì)體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用，將DNA分子包裹入內(nèi)，形成DNA脂復(fù)合物，也能被表面帶負(fù)電的細(xì)胞膜吸附，再通過融合或細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，其轉(zhuǎn)染率較高，優(yōu)于磷酸鈣法。由于脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，所以轉(zhuǎn)染時(shí)間一般不超過24小時(shí)。

常用的脂質(zhì)體主要有兩種，Lipofectin和Lipofectamine。前者是一種陽(yáng)離子脂質(zhì)試劑，可與靶DNA的磷酸骨架結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物能輕易通過細(xì)胞膜從而完成轉(zhuǎn)染過程。Lipofectin可用于轉(zhuǎn)染DNA、RNA和寡核苷酸至各種動(dòng)物細(xì)胞，并可將DNA導(dǎo)入植物原生質(zhì)體。Lipofectamine是一種多陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染試劑，其頭部具獨(dú)特的精胺基團(tuán)，該基團(tuán)的強(qiáng)負(fù)電子性使Lipofectamine具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)染能力。

實(shí)驗(yàn)步驟

(一)貼壁細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)染

1. 在六孔板或35mm培養(yǎng)皿中接種2ml(完全培養(yǎng)基)約1.3×105細(xì)胞。

2. 37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞至50-80％豐度。

3. 在兩個(gè)1.5ml離心管中準(zhǔn)備如下溶液：

溶液A：溶1-2 μg DNA于100μl無(wú)血清培養(yǎng)基中

溶液B：溶2-25μl脂質(zhì)體(GIBCO BRL：LIPOFECTAMINETM Reagent)于100μl無(wú)血清培養(yǎng)基中

4. 將上述A、B兩液混合，室溫下放置15-45分鐘。此時(shí)可將細(xì)胞用2ml無(wú)血清培養(yǎng)基漂洗1-2遍。

5. 混合的A、B兩液中加入0.8ml無(wú)血清培養(yǎng)基，混勻，平鋪在漂洗過的細(xì)胞上。如果細(xì)胞對(duì)無(wú)血清耐受能力差，這一步可加入血清。但是在轉(zhuǎn)染過程中不要加入抗生素(antibiotic)。

6．37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)2-24小時(shí)。

7. 加入lml培養(yǎng)基(含兩倍于正常濃度的血清)。若血清已加入，這一步可加入lml正常的完全培養(yǎng)基。

8. 在轉(zhuǎn)染后的18-24小時(shí)換入新鮮的完全培養(yǎng)基。

9．根據(jù)細(xì)胞類型及啟動(dòng)子的活性，在24-72小時(shí)可對(duì)基因的表達(dá)活性進(jìn)行分析。

10. 在轉(zhuǎn)染后的18-24小時(shí)，可將細(xì)胞按1:10傳入選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。

(二)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

1. 用無(wú)血清、無(wú)抗生素(antibiotic)的培養(yǎng)基漂洗細(xì)胞1-2遍。

2．在六孔板或35mm培養(yǎng)皿中接種0.8ml(無(wú)血清培養(yǎng)基)約2-3×106細(xì)胞。

3. 在兩個(gè)1.5ml離心管中準(zhǔn)備如下溶液：

溶液A：溶1-2μgDNA于100μl無(wú)血清培養(yǎng)基中

溶液B：溶2-25μl脂質(zhì)體(GIBCO BRL：LIPOFECTAMINETM Reagent)無(wú)血清培養(yǎng)基中

4．將上述A、B兩液混合，室溫下放置15-45分鐘。

5．將混合液加入細(xì)胞懸液中，混勻，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)2-24小時(shí)。

6．加入4ml完全培養(yǎng)基，37℃、5％CO2培養(yǎng)24-72小時(shí)．

7．倒掉培養(yǎng)基，藍(lán)光激發(fā)下觀察綠色熒光。

iCell-CRO實(shí)驗(yàn)外包服務(wù)介紹：

    一站式細(xì)胞解決方案

    針對(duì)基礎(chǔ)及臨床研發(fā)中的原代細(xì)胞和iPS細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，由于原代細(xì)胞的分離和培養(yǎng)難度大，iPS細(xì)胞制作和分化的實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，除長(zhǎng)期進(jìn)行原代和iPS培養(yǎng)工作的實(shí)驗(yàn)室，想要獲得足夠量的狀態(tài)好的細(xì)胞比較困難。

    賽百慷依靠多年在細(xì)胞培養(yǎng)方面的積累，為客戶提供完整的細(xì)胞CRO解決方案。根據(jù)客戶需求，直接在細(xì)胞水平進(jìn)行藥物或者試劑的刺激，觀察細(xì)胞狀態(tài)的變化或者特定通路上mRNA或蛋白的變化，也可以先制作動(dòng)物模型，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行處理后，分離特定的原代細(xì)胞進(jìn)行需要的檢測(cè)。

    同時(shí)，我們可以依照客戶提供的具體實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行操作，也可以根據(jù)客戶要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，并根據(jù)客戶實(shí)驗(yàn)的規(guī)模和難度提供詳細(xì)的報(bào)價(jià)和實(shí)驗(yàn)周期規(guī)劃。

服務(wù)項(xiàng)目：

服務(wù)流程：

    1.聯(lián)系我們，溝通客戶實(shí)驗(yàn)計(jì)劃及目標(biāo)，評(píng)估實(shí)驗(yàn)的的可行性。

    2.依照客戶要求，設(shè)計(jì)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)；或客戶已有實(shí)驗(yàn)方案發(fā)送給我們，我們研究方案的可操作性。

    3.確定最終的實(shí)驗(yàn)方案，報(bào)價(jià)和周期。

    4.簽訂服務(wù)合同，支付預(yù)付款。

    5.開始實(shí)驗(yàn)服務(wù)，并定期向客戶反饋和交流。

    6.實(shí)驗(yàn)完成，提供完整實(shí)驗(yàn)說明和部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

    7.支付尾款，向客戶提供完整的全部實(shí)驗(yàn)報(bào)告和原始數(shù)據(jù)。

    8.項(xiàng)目完成。