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免疫組化抗原熱修復(fù)的技術(shù)要點(diǎn)

發(fā)布時(shí)間：2021/6/17 16:45:43      閱讀次數(shù)：752

 一、抗原熱修復(fù)溫度和時(shí)間的關(guān)系

我們?nèi)粘９ぷ髦兴褂玫慕M織固定液福爾馬林會(huì)引起組織蛋白內(nèi)或蛋白之間的亞甲基發(fā)生橋連，具體過(guò)程如下：

第一步：基本反應(yīng)福爾馬林和氫反應(yīng)形成新的化合物；

第二步：基本反應(yīng)福爾馬林和氫反應(yīng)形成新的亞甲基橋。

上述反應(yīng)的結(jié)果導(dǎo)致許多抗原決定簇被封閉，而加熱可以水解該橋連使抗原被激活。影響抗原熱修復(fù)的兩個(gè)最關(guān)鍵的因素是溫度和時(shí)間，有人將這兩種因素對(duì)抗原修復(fù)的影響總結(jié)為下面的公式： 抗原熱修復(fù)的有效性=加熱溫度（T） × 加熱時(shí)間（t）。

也就是說(shuō)當(dāng)我們修復(fù)時(shí)的溫度越低則需要修復(fù)的時(shí)間就越長(zhǎng)；反過(guò)來(lái)當(dāng)修復(fù)溫度增高時(shí)修復(fù)的時(shí)間可以適當(dāng)?shù)乜s短，才能使抗原決定簇完全暴露，這種反比的關(guān)系從MBI單克隆抗體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果“表1”中也可以清楚地看出。

表1 時(shí)間和溫度對(duì)染色的影響
  • 時(shí)間（分鐘）
  • 100℃
  • 80℃
  • 60℃
  • 5×2
  • + + +
  • ―
  • ―
  • 5×6
  • + + + +
  • + + +
  • ―
  • 5×10
  • ―
  • + + + +
  • +
  • 10小時(shí)
  • ―
  • ―
  • + +

如果修復(fù)強(qiáng)度不夠，免疫組織化學(xué)染色所顯示的只能是修復(fù)后暴露的部分抗原決定簇，而不是組織所含的全部抗原。這樣的染色結(jié)果可能會(huì)非常弱，或出現(xiàn)假陰性，即使是陽(yáng)性結(jié)果，充其量只能起到定性的作用，不能適應(yīng)今后對(duì)免疫組化進(jìn)行定量的需要。這就給我們?cè)\斷中定量指標(biāo)的應(yīng)用帶來(lái)困難，例如用來(lái)測(cè)定耐藥的指標(biāo)。

二、組織固定時(shí)間和所需的抗原熱修復(fù)的關(guān)系

大量的實(shí)驗(yàn)表明，固定時(shí)間越長(zhǎng)的標(biāo)本，它所形成的橋連就越緊密，抗原就越難以被激活，所需要的修復(fù)強(qiáng)度也就越強(qiáng)。有意思的是隨著固定時(shí)間的延長(zhǎng)，組織中蛋白對(duì)溫度的耐受也相應(yīng)增高，這可能就是我們對(duì)固定時(shí)間長(zhǎng)的標(biāo)本加大修復(fù)強(qiáng)度的理論基礎(chǔ)。

這就提醒我們?cè)谧龌仡櫺缘难芯繒r(shí)一定要注意所使用的修復(fù)條件，它與新鮮標(biāo)本的修復(fù)條件一定是有所區(qū)別的，同等條件下一定要加長(zhǎng)修復(fù)的時(shí)間或提高修復(fù)所使用的溫度，才可能得到比較滿(mǎn)意的結(jié)果。

三、不同pH值抗原修復(fù)液對(duì)染色結(jié)果的影響

抗原熱修復(fù)中所使用的修復(fù)液pH值也會(huì)對(duì)染色結(jié)果產(chǎn)生相當(dāng)大的影響。

pH值對(duì)染色結(jié)果的影響大概可以分為以下四種情況：

A.穩(wěn)定型，pH值對(duì)染色結(jié)果影響不大，如PCNA、AE1、EMA、CD20等；

B.V型，高pH值和低pH值染色較好，而pH值4-5染色結(jié)果較差，如ER、Ki-67等；

C.上升型，隨著pH值的增加，染色結(jié)果逐漸增強(qiáng)，如HMB45等；

D.下降型，隨著pH值的增加染色結(jié)果逐漸減弱，當(dāng)然這種類(lèi)型的抗體只是個(gè)別的現(xiàn)象，如MOC31。

一個(gè)有趣的現(xiàn)象值得注意，即在高pH值都有較好的染色結(jié)果，所以目前比較推崇的抗原修復(fù)液為高pH值得修復(fù)液，如1mMEDTA, pH8.0或pH9.0等。但是由于傳統(tǒng)習(xí)慣，絕大多數(shù)醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室都在使用pH6.0的枸櫞酸緩沖液。綜合以上各種抗體的染色狀況，考慮到臨床工作的實(shí)際情況，許多國(guó)外免疫組化專(zhuān)家建議，在常規(guī)的免疫組化工作中，全部選用高pH值得修復(fù)液來(lái)代替目前廣為使用的pH6.0枸櫞酸緩沖液。為此，本公司已經(jīng)推出pH8.0和pH9.0的新型抗原修復(fù)液。經(jīng)驗(yàn)證，絕大多數(shù)的抗體使用pH9.0得修復(fù)液效果都要優(yōu)于pH6.0的枸櫞酸，尤其是核陽(yáng)性的抗體。所以，在常規(guī)的免疫組化工作中，使用高pH值的抗原修復(fù)液是今后的必然趨勢(shì)。

四、抗原熱修復(fù)的手段
表2 微波爐修復(fù)和高壓鍋修復(fù)的比較
  •  
  • 溫度
  • 壓力
  • 時(shí)間
  • 受熱
  • 微波爐
  • 100℃
  • 1P
  • 15~20分鐘
  • 不均勻
  • 高壓鍋
  • 120℃
  • 1.2P
  • 噴氣2分鐘
  • 均勻

目前抗原熱修復(fù)所采用的方法主要有微波爐修復(fù)和高壓鍋修復(fù)兩種，從“表2”中可以看出，由于高壓鍋修復(fù)具有溫度均一、節(jié)省時(shí)間、效果穩(wěn)定等特點(diǎn)，已經(jīng)越來(lái)越受到人們的青睞。


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