一、技術(shù)簡(jiǎn)介
Red基因重組技術(shù)，能使外源同源線性DNA片段快速與基因組DNA相應(yīng)基因同源重組，主要包括pKD46、pKD3、pCP20三個(gè)協(xié)助質(zhì)粒。pKD46質(zhì)粒由exo、beta、gam三個(gè)基因組成，它們分別編碼Exo、Beta、Gam三種蛋白質(zhì)，在一定濃度阿拉伯糖誘導(dǎo)下或誘導(dǎo)表達(dá)此三種蛋白。通過(guò)外源構(gòu)建同源線性片段，導(dǎo)入受體菌，在這三種蛋白的協(xié)助下與受體菌基因發(fā)生同源重組，最終實(shí)現(xiàn)基因的突變和缺失。同時(shí)pKD46質(zhì)粒是溫度敏感型質(zhì)粒，42°C條件下其會(huì)自動(dòng)丟失。pKD3為克隆氯霉素抗性基因提供模板,與此同時(shí)在此質(zhì)粒中，Cm兩側(cè)有FRT位點(diǎn)，該位點(diǎn)能夠被FLP重組酶識(shí)別，當(dāng)重組酶存在時(shí)會(huì)將此位點(diǎn)之，間的片段進(jìn)行剪接，從而實(shí)現(xiàn)了Cm'去除，因此不僅為實(shí)驗(yàn)進(jìn)行引入抗性標(biāo)記，方便了重組菌的篩選，更重要的是此抗性標(biāo)記會(huì)在因FRT位點(diǎn)的引入在需要時(shí)被酶切剔除。pCP20能夠表達(dá)FLP重組酶，進(jìn)而識(shí)別重組到基因組上的FRT位點(diǎn)，由此酶切掉兩位點(diǎn)之間引入的抗性基因片段片段，最終實(shí)現(xiàn)目的基因的缺失。pCP20同為溫敏型質(zhì)粒，培養(yǎng)條件高于42°C時(shí)自動(dòng)丟失。
與Red同源重組基因敲除相關(guān)的3個(gè)酶：
1、Exo蛋白：Exo蛋白是一種核酸外切酶，單亞基的分子量為24 kD，Exo蛋白的活性形式是一種環(huán)狀三聚物分子，中間有一中空的通道，通道的一端可容納雙鏈DNA分子，另一端只可容納單鏈DNA。Exo蛋白可結(jié)合在雙鏈DNA的末端，從DNA雙鏈的5’端向3’端降解DNA，使DNA分子形成3’粘性末端。
2、Beta蛋白：Beta蛋白在Red同源重組中起著決定性作用，具有介導(dǎo)互補(bǔ)單鏈DNA退火的功能，是一種退火蛋白，單亞基的分子量為25.8 kD。在溶液中，Beta蛋白自發(fā)地形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，緊緊地結(jié)合在單鏈DNA的3’突出端，防止DNA被單鏈核酸酶降解，并介導(dǎo)互補(bǔ)單鏈DNA的退火。雙鏈DNA退火完成后，Beta蛋白從DNA雙鏈上解離下來(lái)。
3、Gam蛋白：Gam蛋白為16kD的多肽分子，可與RecBCD核酸外切酶結(jié)合，抑制其對(duì)外源DNA的降解作用，防止外源DNA 進(jìn)入細(xì)胞后被宿主降解。
二、實(shí)驗(yàn)步驟
1、制備pKD46/宿主菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)。
2、制備抗性基因打靶片段。
3、電轉(zhuǎn)，篩選陽(yáng)性克隆。
4、導(dǎo)入PCP20質(zhì)粒消除抗性，無(wú)痕敲除。
三、相關(guān)質(zhì)粒（點(diǎn)擊可查看圖譜和序列）
pKD46，氨芐抗性，阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)Red系統(tǒng)重組酶
pKD46-Tet，四環(huán)素抗性，阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)Red系統(tǒng)重組酶
pKD20，氨芐抗性，阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)Red系統(tǒng)重組酶
pREDKI，卡那抗性，I-SceI,阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)Red系統(tǒng)重組酶
pKDsgRNA-ack 阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)Red系統(tǒng)重組酶，四環(huán)素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄sgRNA
pREDCas9：攜帶針對(duì)氨芐基因的gRNA
pKD13，提供卡那霉素抗性重組模板
pKD4，提供卡那霉素抗性重組模板
pKD3，提供氯霉素抗性重組模板
pCP20：FLP重組酶消除抗性
四、參考文獻(xiàn)
[1] Datsenko KA1, Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA. 2000,97(12):6640-6645.
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