1材料
    E.coliJM109菌株
    2儀器、用具
    超凈工作臺、離心機、恒溫搖床、恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、試管、1.5ml離心管、電泳儀、電泳槽、凝膠樣品梳、移液器
    3試劑
    (1)CaCl2、LB平板（見附錄）；SOC培養(yǎng)基（見附錄）；SOB培養(yǎng)基
    (2)RNaseA1；BufferS1；BufferS2；BufferS3；BufferW1；無水乙醇的BufferW2a
    (3)1×電泳緩沖液（TAE）；溴化乙錠溶液（EB）[有毒，小心]；瓊脂糖；6×加樣緩沖液
    (4)酚；
    (5)ddH2O；10×PCRBuffer(Mg2plus)；dNTP；M13；M13-；TaKaRarTaq酶
    4方法
    1.大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備
    (1)取大腸桿菌JM109保存液50μl，接種于4mlLB（或SOB）液體培養(yǎng)基中，37℃，300rpm振蕩培養(yǎng)過夜，第二天取50μl轉(zhuǎn)接到新的4mlLB（或SOB）液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)3h至OD600=0.35～0.4，在無菌操作臺上取1ml菌液于1.5ml離心管中，冰浴10min。
    (2)4℃，5000rpm離心2min，去上清液。
    (3)加入750μl預(yù)冷的0.1MCaCl2重懸菌體，冰浴30min。
    (4)4℃，5000rpm離心2min，棄上清液。
    (5)加入100μl冰冷的0.1MCaCl2輕輕重懸菌體，冰浴2h后，4℃保存?zhèn)溆谩?/span>
    2.重組DNA的轉(zhuǎn)化
    (1)將含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37℃預(yù)熱。
    (2)于100μl感受態(tài)細胞中加入10μl連接產(chǎn)物，冰浴30min。
    (3)將離心管轉(zhuǎn)入42℃水浴，熱沖擊90秒，然后不要搖動離心管，迅速將其放在冰上2min。
    (4)在離心管中加入SOC培養(yǎng)基300μl，槍頭混勻，37℃、150rpm溫和搖振60min。
    (5)將200μl轉(zhuǎn)化菌液均勻地涂布于含50mg/mlAmp、20mg/mlX-gal、200mg/mlIPTG的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜，挑選白色菌落進行鑒定。
    注意事項：
    ①制備感受態(tài)細胞的全部操作均須于冰浴操作，同時注意近火無菌操作，防止感受態(tài)細胞受雜菌污染。
    ②42℃熱處理時很關(guān)鍵，轉(zhuǎn)移速度要快，且溫度要準確。
    ③菌液涂皿操作時，應(yīng)避免反復來回涂布，因為感受態(tài)細菌的細胞壁有了變化，過多的機械擠壓涂布會使細胞破裂，影響轉(zhuǎn)化率。
    3．重組質(zhì)粒的鑒定
    方案一菌落PCR
    (1)制備PCR混合液：
    (2)用經(jīng)滅菌的10μl槍頭（不用牙簽）挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混合液中。
    (3)蓋上離心管得蓋子，在沸水上溫育10min。
    (4)將步驟⑶的樣品冷卻至室溫，離心數(shù)秒，然后于管中加入TaKaRarTaq酶0.25ul。
    (5)按以下條件進行PCR反應(yīng)：94℃預(yù)變性3min；然后進行30個循環(huán)反應(yīng)，其溫度循環(huán)條件為：94℃變性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min；循環(huán)結(jié)束后72℃再延伸5min。
    (6)取5μlPCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。
    方案二質(zhì)粒PCR
    1.堿裂解法少量制備質(zhì)粒DNA
    (1)用離心管收集4ml在LB培養(yǎng)基（含Amp）中培養(yǎng)過夜的菌液，14000rpm離心30秒，棄盡上清。
    (2)用250μl已加入RNaseA1的BufferS1充分懸浮細菌沉淀。
    (3)加入250μlBufferS2，溫和但充分地上下翻轉(zhuǎn)混合4-6次，此步驟不宜超過5min。
    *BufferS2使用后應(yīng)立即蓋緊瓶蓋，以免空氣中的CO2中和BufferS2中的NaOH，降低溶菌效率。
    (4)加入400μlBufferS3，溫和地上下翻轉(zhuǎn)8-10次，室溫靜置2min，14000rpm離心10min。
    *若離心后凝結(jié)塊未沉淀到離心管底部，應(yīng)再上下翻轉(zhuǎn)數(shù)次，12000g離心3min。
    (5)將DNA-prepTube置于2-mlMicrofugeTube中，將步⑷中的混合液移入DNA-prepTube中，5500rpm離心1min。
    (6)棄濾液，將DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，加入500μlBufferW1，5500rpm離心1min。
    (7)棄濾液，將DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，加入700μl已加無水乙醇的BufferW2，5500rpm離心1min，以同樣的方法再用700μl已加無水乙醇的Buffer
    W2洗滌一次。
    (8)棄濾液，將DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，14000rpm離心1min。