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發(fā)布時間：2021/12/8 10:52:58 閱讀次數(shù)：387
一、操作流程
這里以大家最常用的大腸埃希菌為例，其它菌種方法類似。
1.菌種制備：從菌種保藏管中吸取少量菌液，轉(zhuǎn)接到新鮮的TSB中，于30℃-35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時。
2.稀釋：取步驟1的培養(yǎng)物1mL，加入到9mL的pH7.0氯化鈉蛋白質(zhì)緩沖液中，進(jìn)行倍比稀釋。
3.平板計(jì)數(shù)：取稀釋好的菌液，一般取3個稀釋級，每個梯度取2mL，分別加入兩塊90cm的平皿中，每皿加入1mL菌液，傾注45℃左右的已經(jīng)經(jīng)過確定的TSA培養(yǎng)基，輕輕搖勻，靜置，培養(yǎng)基凝固后，置30-35℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48小時。
4.菌落計(jì)數(shù)：將培養(yǎng)后的平板，置于菌落計(jì)數(shù)器下進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，以確定哪個稀釋級的濃度能夠滿足測試的要求。
二、注意事項(xiàng)
1.菌種制備：也可以使用TSA平板進(jìn)行培養(yǎng)，如果轉(zhuǎn)接的是冷凍保藏管中的菌，最好再轉(zhuǎn)接一次，使用第二次轉(zhuǎn)接的菌種。
2.稀釋：取菌液的時候，需要先對菌液進(jìn)行振蕩或吹打混勻，方可吸取菌液。可以不用進(jìn)行倍比稀釋，只要能保證最后加入到測試樣品中的菌的數(shù)量符合要求即可。
3.平板計(jì)數(shù)：取菌液時同樣需要先將試管中的菌液進(jìn)行混勻。
4.培養(yǎng)基菌落計(jì)數(shù)：不建議逐日觀察結(jié)果，因?yàn)槠桨逯锌赡苡心?逐日觀察拿動平板，可能會導(dǎo)致水落到菌落上，菌跟著水流到下一個空白地方，導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確；另外如果是霉菌，因?yàn)橛墟咦樱脛右矔䦟?dǎo)致孢子落到平板空白地方，影響結(jié)果。
三、事后思考
1.菌液的作用
菌懸液使用有時效性要求
2020版《中國藥典》和《歐洲藥典》8.0版要求如果放置在室溫，菌懸液必須在2小時內(nèi)使用，如果放置在2-8℃保存，可以在24小時內(nèi)使用。
那么問題來了，菌懸液的菌的數(shù)量需要在48小時后才能確定，但是在24小時之內(nèi)菌懸液必須使用，所以在不知道菌含量的情況下，樣品測試需要做至少三個梯度。
筆者之前在微生物實(shí)驗(yàn)室做了5次的菌懸液制備，為了保證實(shí)驗(yàn)的成功，每次都是要做三個梯度，雖然大多數(shù)都是同一個稀釋級的含量符合要求，但是還是偶爾有另一個稀釋級才符合要求的時候，所以筆者每次都乖乖的做三個梯度的測試，還好筆者那個時候依據(jù)的法規(guī)中，日常的無菌檢查和控制菌檢查中沒有陽性對照的要求。
這里說的三個梯度不是說只是計(jì)數(shù)，而是菌懸液實(shí)際運(yùn)用的測試中也需要三個梯度，舉個例子，某個無菌產(chǎn)品無菌檢查中的陽性對照測試，需要做三個對照。當(dāng)然，同樣的產(chǎn)品方法適用性，培養(yǎng)基促生長測試也是如此。流程圖如下：
2.步驟的繁瑣
這個流程圖中，還是省略了一些步驟，一句話帶過的倍比稀釋，做過的小伙伴們知道，這個說起來容易做起來難。
另外在接收菌種和從冷凍保藏管中取出菌種來使用時，還需要進(jìn)行相應(yīng)的鑒定，所以不要覺得這個流程好冗長，其實(shí)已經(jīng)是簡單版的。
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