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發(fā)布時(shí)間：2021/12/16 9:12:34 閱讀次數(shù)：672
血清制備
1.取血后，37oC 下，讓血液凝固 1 到 2 小時(shí)（不加抗凝劑）；
2.4oC 冰箱過(guò)夜（讓血塊固縮）；
3.當(dāng)血清自然析出后， 4oC，3000 轉(zhuǎn)/分，離心 10 分鐘，分離血清，棄去不溶物；
4.將血清移至一干凈試管，并分裝成小份，儲(chǔ)藏在-80oC。
ELISA
一、包被抗原
1.用 50mM 的碳酸鹽包被緩沖液（pH 9.6）溶解 抗 原 ，使抗原濃度為 10-20 μg/ml，加 100 μl/孔到 96 孔酶標(biāo)板，4 oC 放置過(guò)夜。
2. 第二天棄去包被液后，用 PBST 洗滌 3 次，每孔加入 150 μl 1％ BSA 37 oC封閉 1 小時(shí)。
3. PBST 洗滌 3 次后，每孔加入 100 μl 不同倍比稀釋度的血清，并加入對(duì)照樣品，37 oC 孵育 2 小時(shí)。
4. PBST 洗滌 5 次后，加入 100μl 稀釋后的 HRP 標(biāo)記的二抗，37 oC 孵育 1 小時(shí) 。
5. PBST 洗滌 5 次后，顯色劑顯色 20 min 后，酶標(biāo)儀上讀取 A405 吸收值。
二、包被細(xì)胞
1.在 96 孔培養(yǎng)板上接種細(xì)胞數(shù)為 1 x 104 cells/well，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。
2. 第二天用 PBS 洗滌培養(yǎng)板 2-3 次。
3. 加入 125 ?l/well 10% Formalin（1:10 稀釋）, 室溫下固定 15 min。
4. 用 ddH2O 洗滌培養(yǎng)板 3 次，并晾干，儲(chǔ)藏在 2-8oC 備用。
5. 用 PBST 洗滌 3 次，每孔加入 150 μl 1％ BSA 37 oC 封閉 1 小時(shí)。
6. PBST 洗滌 3 次后，每孔加入 100 μl 不同倍比稀釋度的血清，并加入對(duì)照樣品，37 oC 孵育 2 小時(shí)。
7. PBST 洗滌 5 次后，加入 100 μl 稀釋后的 HRP 標(biāo)記的二抗,37 oC 孵育 1 小時(shí)。
8. PBST 洗滌 5 次后，顯色劑顯色 20 min 后，酶標(biāo)儀上讀取 A405 吸收值。50mM 的碳酸鹽包被緩沖液：0.05mol/L pH9.6 碳酸緩沖液,4℃，保存,Na2CO3 0.15 克, NaHCO3 0.293 克,蒸餾水稀釋至 100 ml。ABTS 作為底物進(jìn)行顯色反應(yīng)(10ml)：
0.2M
Na2HPO4
2.4ml
0.1M
檸檬酸 2.6ml
ddH2O
5ml
ABTS
5mg
H2O2(30%)
4ul（用前加入）
注意：
一般做倍比稀釋進(jìn)行檢測(cè)，需要有相應(yīng)的對(duì)照血清。
不同的顯色系統(tǒng)對(duì)應(yīng)不同的光吸收值。
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