1. 準(zhǔn)備：MSC 細(xì)胞培養(yǎng)基配制：MSC 專用基礎(chǔ)培養(yǎng)基 440 ml+FDCC 胎牛血清 50 ml+青霉素 5 ml+谷氨酸鹽 5 ml（一般分裝成 10 管 50 ml，后考慮 1 株僅傳 3~5 代約需最多 5 管）。并于培養(yǎng)室內(nèi)提前準(zhǔn)備 T25 培養(yǎng)瓶、15 ml 離心管、50 ml 離心管、一次性塑料移液管，培養(yǎng)室外準(zhǔn)備帽子、口罩、手套、燒杯、記號(hào)筆等準(zhǔn)備帶入。提前確保超凈臺(tái)和水浴鍋以及 37 度培養(yǎng)箱、4 度離心機(jī)可供使用。
2. 解凍：預(yù)冷 4 度離心機(jī)，先將東西帶進(jìn)培養(yǎng)室，而后超凈臺(tái)消毒，打開水浴鍋預(yù)熱，將 1 管配好的 MSC 培養(yǎng)基預(yù)熱。從 -80 度冰箱迅速取出凍存的細(xì)胞株，將冷凍管立即放入 37 ℃ 水浴鍋中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化。
3. 種瓶：酒精棉球消毒外表面，然后打開此凍存管，用無菌移液管移至 15 ml 離心管中，吸取 1 ml（此時(shí)的培養(yǎng)基是復(fù)蘇細(xì)胞用，最好不預(yù)熱，減少 DMSO 對細(xì)胞損傷）MSC 培養(yǎng)基加入凍存管中輕吹打以吸取殘余的細(xì)胞至離心管中，用 1 ml 大槍在離心管中均勻吹打至無沉淀，但亦要無氣泡，拿至 4 度離心機(jī)在 250 g 轉(zhuǎn)速下離心 5 min，回超凈臺(tái)吸走上清（寧可殘留部分上清液也不要戳入底部細(xì)胞團(tuán)中），再加入 2~3 ml 預(yù)熱的 MSC 培養(yǎng)基輕柔重懸細(xì)胞，保證細(xì)胞分布均勻（無氣泡），用移液槍將離心管中的細(xì)胞懸液移到豎立的干凈 T25 培養(yǎng)瓶中，然后酒精棉球擦口后封口放倒前后左右平移保證其在瓶底面均勻鋪開（但不要碰到瓶口三角區(qū)以防后續(xù)污染）。記號(hào)筆標(biāo)記，5% 濃度 CO2 下 37 度孵育過夜。
4. 種瓶后首次換液：先預(yù)熱培養(yǎng)基，消毒臺(tái)面，而后從溫箱中取出培養(yǎng)瓶，先鏡下觀察粗估懸浮以及貼壁細(xì)胞比例，而后回臺(tái)面用一次性塑料移液管吸盡上清，再加加入 4 ml 預(yù)熱好的 MSC 培養(yǎng)基，酒精棉球消毒瓶口，封口后送入溫箱。
5. 后續(xù)換液：每 2~3 天換液一次，視細(xì)胞量而定，頻繁換液不利于細(xì)胞對于二氧化碳攝入。
6. 傳代：細(xì)胞生長達(dá) 70% 融合即可進(jìn)行
（1）消毒臺(tái)面，預(yù)熱培養(yǎng)基，1 × PBS 以及胰酶至 37 度
（2）從原培養(yǎng)瓶中吸走廢液
（3）將預(yù)熱的 PBS 加 3 ml 至培養(yǎng)瓶中，注意加時(shí)不要沖到細(xì)胞層那面瓶壁，輕柔漂洗，再棄去 PBS，重復(fù)此步 1 次
（4）吸盡 PBS 加入 0.5~1 ml 0.25% 胰酶進(jìn)行消化，鏡下觀察待細(xì)胞變圓即將脫落時(shí)立即拿到超凈臺(tái)吸去消化液，再加入預(yù)熱的培養(yǎng)液輕輕吹打至細(xì)胞脫落
（5）分多次將細(xì)胞懸液移至 15 ml 離心管中，殘余細(xì)胞也用培養(yǎng)基洗下來一并加入。
（6）250 g 離心 5 min
（7）至超凈臺(tái)吸走上清，加入細(xì)胞培養(yǎng)基，吹打重懸
（8）向兩個(gè) T25 培養(yǎng)瓶中分別加入 2 ml 培養(yǎng)基，消毒瓶口后封口標(biāo)記，送入溫箱（具體可視消化后細(xì)胞稠密度大致決定分幾瓶）
7. 種板：對于 MSC 細(xì)胞當(dāng)傳到第 3 代或第 4 代時(shí)種板最佳，第 6 代起細(xì)胞變的肥大基本貼壁及增殖能力就很弱了，不容易抵擋種板這一損傷最大的細(xì)胞事件，消化前細(xì)胞分布約占每視野的 70% 以上，超過 90% 則提示傳代晚了。
（注：我們一般對含因子較多的培養(yǎng)基不反復(fù)預(yù)熱，只需提前取出接近室溫即可使用，反復(fù)預(yù)熱對因子破壞大）
