免疫組化技術(shù)由于具有特異性強(qiáng)、敏感性高、定位準(zhǔn)確的特點(diǎn)，對(duì)于疾病的診斷與鑒別診斷有著重要意義，當(dāng)免疫組化結(jié)果沒(méi)有出現(xiàn)預(yù)期的效果時(shí)，應(yīng)系統(tǒng)的分析和查找原因，找到有效的解決辦法。

      IHC實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，包括切片制作（固定，脫水，透明，包埋，切片，貼片，烤片），脫蠟，水化，阻斷，抗原修復(fù)，封閉，一抗孵育，二抗孵育，顯色，復(fù)染，封片和分析等，在上次的推文中向您介紹了切片制作和抗原修復(fù)兩個(gè)步驟中的常見(jiàn)問(wèn)題及解析，本次為您帶來(lái)的是封閉和一抗孵育中的注意事項(xiàng)。文末還附有IHC通關(guān)的秘密武器——Bioss全新上市的IHC即用型試劑盒，助您一次獲得文獻(xiàn)級(jí)的圖像結(jié)果。

封閉

1.圖片背景值過(guò)高。

解決方法：①在使用抗體前采用溶于甲醇或水的3% H2O2或使用專(zhuān)門(mén)的試劑盒進(jìn)行淬滅，并使用堿性磷酸酶抑制劑，以減少內(nèi)源性過(guò)氧化物酶或磷酸酶的干擾；

②使用生物素類(lèi)的二抗系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)如腎臟和肝臟等富含生物素的組織樣本時(shí)，可以在一抗孵育前用親和素/生物素封閉試劑進(jìn)行封閉，以減少內(nèi)源性生物素活性的干擾；

③在加入抗體前把多余的緩沖液吸干，而非對(duì)組織樣品進(jìn)行洗滌，以減少來(lái)自?xún)?nèi)源性酶的干擾；

④蛋白封閉時(shí)間不足導(dǎo)致背景增強(qiáng)甚至出現(xiàn)假陽(yáng)性，應(yīng)選擇合適的封閉液，適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間；

⑤所用血清溶血，應(yīng)選擇合適的封閉液。

2.染色結(jié)果呈假陰性。解決方法：①封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致陽(yáng)性信號(hào)減弱甚至出現(xiàn)假陰性，應(yīng)選擇合適的封閉液，適當(dāng)減少封閉時(shí)間；②血清封閉液和一抗來(lái)源種屬相同，血清中的抗體可能和目的蛋白特異性結(jié)合了，進(jìn)而導(dǎo)致一抗沒(méi)有結(jié)合位點(diǎn)，產(chǎn)生假陰性。

3.目標(biāo)蛋白定位異常。解決方法：①熱滅活正常血清或BSA對(duì)組織進(jìn)行封閉孵育。

一抗孵育

1.圖片背景值過(guò)高。

解決方法：①抗體孵育后洗滌不充分，殘留抗體導(dǎo)致背景染色，建議增加抗體孵育后的浸洗次數(shù)，延長(zhǎng)浸洗時(shí)間。

2.染色結(jié)果過(guò)強(qiáng)。解決方法：①一抗?jié)舛冗^(guò)高是常見(jiàn)原因之一，可適當(dāng)調(diào)整抗體稀釋比；②一抗孵育溫度高，時(shí)間長(zhǎng)，一般建議4℃過(guò)夜孵育，低溫雖然會(huì)使抗體結(jié)合緩慢，但特異性結(jié)合更好。

3.陽(yáng)性檢測(cè)率及著色強(qiáng)度相對(duì)減弱，甚至無(wú)染色。解決方法：①抗體效價(jià)不高�？赏ㄟ^(guò)增加抗體使用濃度，延長(zhǎng)抗體孵育時(shí)間進(jìn)行調(diào)整；②所用抗體不適用于IHC實(shí)驗(yàn)。建議在非變性WB上測(cè)試該抗體，以確�？贵w識(shí)別非變性抗原，或是選用通過(guò)IHC實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的抗體；③一抗二抗不匹配。使用針對(duì)一抗物種來(lái)源的二抗，如一抗宿主為rabbit，則須使用anti-rabbit的二抗；④抗體失活。避免將標(biāo)記熒光基團(tuán)的二抗放置于光照環(huán)境；⑤靶蛋白為核蛋白而抗體不能穿透細(xì)胞核時(shí)，建議在封閉溶液與抗體稀釋液中加入合適的滲透試劑，例如Triton X-100，以促進(jìn)抗體滲透到細(xì)胞內(nèi)。

4.染色結(jié)果呈弱陽(yáng)性。解決方法：①適當(dāng)調(diào)整抗體稀釋比，或者選擇染色強(qiáng)度高，高親和力的抗體；②設(shè)置陽(yáng)性組織切片的對(duì)照，因?yàn)橥�一蛋白在不同組織中的表達(dá)會(huì)有很大的差異；③切片在染色過(guò)程中抗體過(guò)濃或干燥了。切片上遺留了過(guò)多的沖洗液，當(dāng)抗體加至切片上時(shí)；等于人為地對(duì)抗體進(jìn)行了進(jìn)一步的稀釋?zhuān)�滴加試劑前�?yīng)盡量減少殘余液體。

5.染色結(jié)果出現(xiàn)非特異性染色。解決方法：①可以通過(guò)調(diào)整抗體的稀釋比進(jìn)行改善，特異性強(qiáng)的抗體則不易受稀釋比的影響；②一抗?jié)舛忍�高，在使用新抗體前可以通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索出最理想的工作濃度，不能簡(jiǎn)單地按照說(shuō)明書(shū)來(lái)用；③孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或孵育溫度過(guò)高，建議摸索不同抗體的最佳孵育條件；④一抗非特異性結(jié)合過(guò)高，可通過(guò)降低一抗?jié)舛然蚩s短孵育時(shí)間進(jìn)行改善；⑤一抗與實(shí)驗(yàn)組織同源，加入二抗后，二抗與組織結(jié)合。應(yīng)換與組織非同源的一抗；⑥一抗為多抗，建議更換為單克隆抗體；⑦抗體稀釋液中添加非離子型去污劑包括Triton X-100或Tween 20減少非特異性疏水相互作用。