鹽酸克倫特羅檢測試劑盒使用說明書

（酶聯(lián)免疫法）

 1 原理及用途

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測尿樣、組織、飼料等樣本中的鹽酸克倫特羅（Clenbuterol，CLE），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液，樣本中的鹽酸克倫特羅和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗鹽酸克倫特羅抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含鹽酸克倫特羅含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中鹽酸克倫特羅的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度：0.05ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式：25℃，30min～15min

2.3 檢測下限：

尿樣……………………………0.1ppb

組織……………………………0.2ppb

飼料……………………………1ppb

豬肝……………………………0.5ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

克倫特羅………………………100%

特普他林………………………<1%

馬布特羅………………………<1%

溴布特羅………………………<1%

沙丁胺醇………………………<1%

萊克多巴胺……………………<1%

 2.5 樣本回收率：

尿樣……………………………95%±10%

組織、飼料、豬肝……………85%±15%

3 試劑盒組成

酶標(biāo)板……………………………96孔

標(biāo)準(zhǔn)液：各1ml

0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb

高標(biāo)準(zhǔn)液（紅蓋）：100ppb………1ml

酶標(biāo)記物（紅蓋）…………………5.5ml

抗體工作液（藍(lán)蓋）………………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

10×復(fù)溶液(黃蓋)  …………………50ml

說明書…………………………………1份

蓋板膜…………………………………1張

自封袋…………………………………1個

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：氫氧化鈉、乙酸乙酯、濃鹽酸、甲醇、無水碳酸鈉 

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：復(fù)溶液

將10×復(fù)溶液用去離子水10倍稀釋（1份10×復(fù)溶液加9份去離子水），用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。

配液2：工作洗滌液

將20×濃縮洗滌液20倍稀釋(1份20×濃縮洗滌液加19份去離子水)。

配液3：樣本提取液

70%甲醇，即V甲醇:V去離子水=7：3。

配液4：10%碳酸鈉溶液

    取50g無水碳酸鈉加去離子水混勻溶解，定容至450ml。

配液5：0.1M鹽酸溶液

    稱取860ul濃鹽酸加去離子水混勻，定容至100ml。

配液6：2M氫氧化鈉溶液

    稱取8g氫氧化鈉加去離子水混勻溶解，定容至100ml。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 尿樣處理方法：

    取1ml清亮尿樣（渾濁尿樣需要過濾或經(jīng)4000r/min離心5min以得到清亮尿樣）于10ml離心管中，加入1ml復(fù)溶液（配液1），混合振蕩30s，取50µl進(jìn)行分析。暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存。

樣本稀釋倍數(shù)：2   檢測下限：0.1ppb

5.3.2 組織樣本處理方法：

   稱取均質(zhì)后的組織樣本1g±0.05g，加入3ml復(fù)溶液（配液1），充分振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min (若組織樣本中油脂含量較高，可在振蕩后放入85℃水浴10min后再離心)。取50µl上清液進(jìn)行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：4    檢測下限：0.2ppb

5.3.3 飼料樣本處理方法：

1）稱取粉碎后的飼料樣本1g±0.05g于15ml離心管中，加入4ml樣本提取液(配液3)，振蕩混勻2min，室溫 4000r/min以上離心10min；

2）取上清液0.1ml于1.5ml離心管中，再加入0.4ml復(fù)溶液(配液1)，振蕩混勻30s，取50ul分析。

樣本稀釋倍數(shù)：20    檢測下限：1ppb

5.3.4豬肝樣本處理辦法

1)稱取均質(zhì)后的豬肝樣本1g±0.05g于15ml離心管中，加入1ml 10%碳酸鈉溶液（配液4）,振蕩混勻2min，加入4ml乙酸乙酯溶液，振蕩混勻5min，室溫4000r/min以上離心10min；

2）取上層有機(jī)液2ml于15ml離心管中，加入1ml 0.1M鹽酸溶液（配液5），振蕩混勻2min，室溫4000r/min以上離心5min；

3）取下層清液0.1ml于1.5ml離心管中，加入0.4ml復(fù)溶液（配液1），用2M 氫氧化鈉溶液（配液6）調(diào)PH至 7 左右，取50ul分析。

樣本稀釋倍數(shù)：10    檢測下限：0.5ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

6.1 編    號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)30分鐘。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加350ul工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，最后一次拍干（用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘（若藍(lán)色過淺，可適當(dāng)延長反應(yīng)時間）。

6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.6 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析 鹽酸克倫特羅檢測試劑盒使用說明書

7.1 百分吸光率的計算

    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索�。�

8 注意事項

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。

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