發(fā)布時(shí)間：2024/7/12 9:00:58 閱讀次數(shù)：74
人免疫缺陷病毒 1 型 & 2 型雙重探針法熒光定量RT- PCR試劑盒
H u m a n I m m u n o d e fi c i e n c y V i r u s I & II D o u bl e p r o b e RT - q P C R K i t
產(chǎn)品及特點(diǎn)
人類免疫缺陷病毒（HIV）是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，能導(dǎo)致獲得性免疫缺陷綜合征（AIDS）， 這是一種嚴(yán)重的、致死性的傳染病。 HIV 主要通過性接觸、血液傳播和母嬰傳播等方式傳 播，感染后會(huì)使機(jī)體免疫功能受損，最終并發(fā)各種機(jī)會(huì)性感染和腫瘤。可分為 HIV1 和 HIV2。本試劑盒可在一次反應(yīng)中快速檢測兩種病毒：HIV1 和 HIV2。根據(jù)探針法熒光定 量 RT-PCR 原理開發(fā)，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需要提供核酸（含 DNA 和RNA）模板。
2. 提供兩種病毒的陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
3. 反應(yīng)快速，靈敏度高。
4. 對所有單個(gè)病原體的高靈敏度和強(qiáng)特異性。
5. 可用于高通量檢測。
6. 本試劑盒足夠做 25μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 50 次，只能用于科研。
成分規(guī)格
| 產(chǎn)品組成 | 編號(hào) | 規(guī)格 |
| 2 × OneStep Probe Mix | GZ021101a | 650 μl |
| OneStep Probe Enzyme Mix | GZ021102b | 55 μl |
| DEPC-H2O | GZ070401 | 1 ml |
| 熒光模板稀釋液 | GZ070407 | 1 ml |
| HIV1& HIV2 雙重 RT-qPCR 引物-探針混合液 |
GZ1588299yp |
160μl |
| HIV1& HIV2 雙重 RT-qPCR 陽性對照 (1×10E8 拷貝/μL) |
GZ1588299pc |
60 μl |
保存條件
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為一年。陽性對照需要單獨(dú)放置，不要污染其他試 劑。
使用方法
一、核酸提取(樣本制備區(qū))
用自選方法提取純化樣品核酸，本試劑盒跟市場上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼容。病 毒基因組 DNA/RNA 提取試劑盒（離心柱型）提取核酸。
二、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(樣本制備區(qū))
（由于陽性對照濃度高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，避免污染樣 品或本試劑盒的其他成分）。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7 ，6 ，5 ，4 ，3 ，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光模板稀釋液，（最好用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘， 得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震 蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震 蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。 若無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將陽性對照稀釋到 1×10E5 拷貝/μL 即可。
三、試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))
若有 N 個(gè)待檢樣品，準(zhǔn)備 N+2 個(gè) qPCR 管(N 個(gè)待檢樣品+1個(gè)陰性對照+6 個(gè)陽性對 照) ，向各 PCR 管中分別加入下列成分。
| 成分 | N 個(gè) 待檢樣品管 | qPCR 陰性對照 | qPCR 陽性對照 |
| 2 × OneStep Probe Mix | 各 12.5 μL | 12.5 μL | 12.5 μL |
| OneStep Probe Enzyme Mix | 各 1 μL | 1 μL | 1 μL |
| HIV1& HIV2 雙重 RT-qPCR 引物-探針混合液 | 各 3 μL |
3 μL |
3 μL |
| DEPC-H2O | 各 6.5 μL | 6.5 μL | 6.5 μL |
轉(zhuǎn)移至樣本準(zhǔn)備區(qū)。
四、添加模板(模板添加區(qū))
向 qPCR 管中分別加入 2μl 模板，順序?yàn)殛幮詫φ眨?/font>DEPC-H2O）、待測樣品模板、
HIV1& HIV2 雙重 RT-qPCR 陽性對照，離心 30 秒，立即進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
五、擴(kuò)增反應(yīng)(擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū))
將 qPCR 管放置在 qPCR 擴(kuò)增儀器樣品槽相應(yīng)位置，進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：
| 過程 | 溫度 | 時(shí)間 |
| 反轉(zhuǎn)錄 | 50℃ | 15 min |
| 預(yù)變性 | 95℃ | 3 min |
| qPCR 反應(yīng) （40 個(gè)循環(huán)） | 95℃ | 15 sec |
| 60℃ | 20 sec | |
|
信號(hào)通道 | 同時(shí)選擇 FAM/VIC 通道采集 熒光信號(hào) | |
熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)選擇如下表：
| Target | 熒光基團(tuán) | 猝滅基團(tuán) |
| HIV1 | FAM | BHQ1 |
| HIV2 | VIC | BHQ1 |
六、結(jié)果分析
1. 如果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA/RNA 濃度的 log 值，推 算出其濃度。
2. 如果無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照如下標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果：
陽性對照結(jié)果：Ct 值<30 ，有明顯指數(shù)增長，呈典型的 S 型曲線。 陰性對照結(jié)果：Ct 值>38 或無 Ct 值，無明顯指數(shù)增長期和平臺(tái)期。
樣本檢測結(jié)果：Ct 值<35 ，有明顯指數(shù)增長，表明樣本中檢測出該病毒，結(jié)果為陽 性；Ct 值>38 或無 Ct 值，表明樣本中未檢測出該病毒，結(jié)果為陰性；Ct 值在 35-38 范 圍，應(yīng)對樣本進(jìn)行復(fù)檢，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Ct 值仍在 35~38 范圍，有明顯指數(shù)增長，則 判定為陽性，否則為陰性。
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