黃曲霉毒素B1檢測(cè)試劑盒說明書

（酶聯(lián)免疫法）

 1 原理及用途

本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)谷物、飼料等樣本中的黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測(cè)時(shí)，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液，樣本中的黃曲霉毒素B1和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗黃曲霉毒素B1抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含黃曲霉毒素B1含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中黃曲霉毒素B1的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度：0.03ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式：25℃，30min～15min

2.3 檢測(cè)下限：

谷物…………………………………………0.15ppb

玉米皮、麩皮等吸水性強(qiáng)樣本……………0.6ppb

食用油、花生油……………………………0.6ppb

醬類、餅干、糕點(diǎn)等食品或調(diào)料…………0.6ppb

啤酒…………………………………………0.3ppb

葡萄酒、醬油、醋…………………………0.15ppb

茶葉…………………………………………0.2ppb

麥類…………………………………………1.2ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

黃曲霉毒素B1…………………………100%

2.5 樣本回收率：

谷物…………………………………85±15%

花生油………………………………82±15%

食用油………………………………85±15%

醬類、餅干、糕點(diǎn)等食品或調(diào)料…83±15%

啤酒…………………………………84±15%

葡萄酒、醬油、醋…………………87±15%

茶葉、麥類…………………………75±15%

3 試劑盒組成

酶標(biāo)板……………………………96孔

標(biāo)準(zhǔn)液（黑蓋）：各1ml

0ppb、0.03ppb、0.06ppb、0.12ppb、0.24ppb、0.48ppb

高標(biāo)準(zhǔn)液：100ppb …………………1ml

酶標(biāo)記物（紅蓋） …………………5.5ml

抗體工作液（藍(lán)蓋） ………………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

說明書 ………………………………1份

蓋板膜…………………………………1張

自封袋…………………………………1個(gè)

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：?jiǎn)蔚?0µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：甲醇、正己烷、三氯甲烷

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實(shí)驗(yàn)器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：樣本提取液

70%甲醇，即V甲醇:V去離子水=7：3。

配液2：工作洗滌液

將20×濃縮洗滌液20倍稀釋(1份20×濃縮洗滌液加19份去離子水)。

配液3：樣本復(fù)溶液

35%甲醇，即V甲醇:V去離子水=3.5：6.5。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 谷物處理方法 

1）稱取2g±0.05g粉碎樣本于50ml離心管中，加5ml樣本提取液（配液1），振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

2）取0.5ml上清，加入0.5ml去離子水，混勻；

3）取50µl進(jìn)行分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：5    檢測(cè)下限：0.15ppb

5.3.2 玉米皮、麥麩等吸水性強(qiáng)樣本處理方法 

1）稱取2g±0.05g粉碎樣本于50ml離心管中，加20ml樣本提取液（配液1），振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

2）取0.5ml上清，加入0.5ml去離子水，混勻；（對(duì)于毒素含量極高的樣本可用樣本復(fù)溶液（配液3）稀釋后再測(cè)。比如取2）中的混合液0.1ml加0.9ml樣本復(fù)溶液（配液3）混勻，最終樣本稀釋倍數(shù)為200，檢測(cè)下限為6ppb。）

3）取50µl進(jìn)行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：20    檢測(cè)下限：0.6ppb

注：由于毒素在樣本中的分布呈非均勻狀態(tài)，取樣時(shí)需多點(diǎn)取樣充分混勻后再取2g進(jìn)行試驗(yàn)。

5.3.3 食用油、花生油處理方法

1）稱取2ml樣本于50ml離心管中，加8ml正己烷和10ml樣本提取液（配液1），振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

2）去除上層液體，取0.5ml下層液體加入0.5ml去離子水，混勻，再取混勻液體0.5ml加入0.5ml樣本復(fù)溶液（配液3），振蕩30s；

3）取50µl進(jìn)行分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：20    檢測(cè)下限：0.6ppb

5.3.4 醬類、餅干、糕點(diǎn)等食品或調(diào)料處理方法

1）稱取1g±0.05g粉碎樣本至15ml離心管中，加10ml甲醇，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；

2）取2ml上清至15ml離心管中，于50℃-60℃下氮?dú)饣蚩諝獯蹈桑?/span>

3）加入2ml去離子水，振蕩30s，再加入6ml三氯甲烷，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；

4）取下層三氯甲烷液1.5ml至10ml離心管，于50℃-60℃下氮?dú)饣蚩諝獯蹈桑?/span>

5）加入0.5ml正己烷，振蕩30s，再加入1ml樣本復(fù)溶液（配液3），振蕩1分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；

6）去除上層有機(jī)物相，取下層清液50µl分析。。

樣本稀釋倍數(shù)：20倍       檢測(cè)下限：0.6ppb

5.3.5 啤酒處理方法

1）將啤酒充分?jǐn)嚢瑁ㄈコ�二氧化碳），�?ml啤酒樣本，加入1ml蒸餾水，再加入7ml甲醇，振蕩5分鐘；

2）取混勻后的樣本液0.5ml加入0.5ml去離子水，混勻；

3）取50µl進(jìn)行分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：10    檢測(cè)下限：0.3ppb

5.3.6 葡萄酒、醬油、醋處理方法

1）取2ml樣本，加入2ml蒸餾水，再加入10ml三氯甲烷，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

2）取下層液體1ml于50-60℃下氮?dú)饣蚩諝庀麓蹈桑?/font>

3）加入0.5ml樣本提取液（配液1）充分溶解干燥物，再加入0.5ml去離子水，混勻；

4）取50µl進(jìn)行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：5    檢測(cè)下限：0.15ppb

5.3.7 茶葉處理方法

1）稱取2g±0.05g粉碎樣本于50ml離心管中，加4ml甲醇溶液，振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

2）取0.3ml上清，加入0.6ml去離子水，混勻；

3）取50µl進(jìn)行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：6    檢測(cè)下限：0.2ppb

5.3.8 麥類處理方法 

1）稱取1g±0.05g粉碎樣本于50ml離心管中，加入2ml樣本提取液（配液1），振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

2）取0.2ml上清，加入0.2ml去離子水，振蕩30秒，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；

3）取離心后的樣本液0.1ml加入0.9ml樣本復(fù)溶液（配液3），混勻。

4）取50µl進(jìn)行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：40    檢測(cè)下限：1.2ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時(shí)可能會(huì)有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

6.1 編    號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)30分鐘。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加350µl工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，最后一次拍干（用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘（若藍(lán)色過淺，可適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間）。

6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.6 測(cè)吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔吸光度值（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm）。測(cè)定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計(jì)算

    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對(duì)數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測(cè)物的實(shí)際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索取）

8 注意事項(xiàng)

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。

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