今天推薦的是由廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院和廈門(mén)大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科發(fā)表在American Journal of Reproductive Immunology的一篇文章，通訊作者是Qiong-Hua Chen教授。

文章摘要

問(wèn)題：來(lái)自子宮內(nèi)膜異位癥患者的原代在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞在研究中的應(yīng)用由于壽命短、激素反應(yīng)性去分化而受到限制。

研究方法：人類(lèi)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 (hTERT) 誘導(dǎo)的永生化細(xì)胞 (iheESCs) 被慢病毒感染。通過(guò) qRTPCR 檢查 mRNA 水平，并通過(guò)蛋白質(zhì)印跡定量蛋白質(zhì)表達(dá)。 CCK-8 和 EdU 測(cè)定被指定用于評(píng)估增殖。通過(guò)transwell測(cè)定評(píng)估細(xì)胞的遷移和侵襲�？寺⌒纬稍囼�(yàn)和裸鼠致瘤性試驗(yàn)用于評(píng)估集落形成和致瘤能力。

結(jié)果：與原代細(xì)胞相比，hTERT mRNA 和蛋白質(zhì)在 iheESCs 中的表達(dá)顯著高于原代細(xì)胞。 iheESCs 生長(zhǎng) 42 代沒(méi)有形態(tài)變化，這比原代細(xì)胞的 18 代長(zhǎng)得多。原代細(xì)胞和iheESCs在生長(zhǎng)、遷移率和染色體核型上沒(méi)有明顯差異。此外，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT) 標(biāo)志物和雌激素/孕激素受體的表達(dá)保持不變。黃體tong和 cAMP 可以誘導(dǎo) iheESCs 的蛻膜化。雌激素增加iheESCs的增殖和遷移能力，脂多糖(LPS)誘導(dǎo)IL-1β和IL-6促進(jìn)炎癥反應(yīng)。與原代細(xì)胞一樣，iheESCs 的集落形成能力低于 Ishikawa 細(xì)胞。此外，致瘤性測(cè)定表明，iheESCs 不能在 BALB/c 裸鼠中引發(fā)腫瘤形成。

結(jié)論：本研究建立并表征了 iheESCs，它保持了原代細(xì)胞的細(xì)胞生理學(xué)并且不具有致瘤能力。

因此，iheESCs 可用作體外細(xì)胞模型來(lái)研究子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制。

研究背景

子宮內(nèi)膜異位癥的經(jīng)典定義是存在子宮內(nèi)位置之外的子宮內(nèi)膜組織。子宮內(nèi)膜異位癥是一種雌激素依賴(lài)性炎癥性疾病，可導(dǎo)致慢性盆腔疼痛、痛經(jīng)、不規(guī)則子宮出血和不孕癥。1,2 育齡女性盆腔子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生率接近 10%。3 此外，子宮內(nèi)膜異位癥的復(fù)發(fā)率子宮內(nèi)膜異位癥達(dá)6%-67%，部分患者需要3次或以上手術(shù)4。因此，子宮內(nèi)膜異位癥嚴(yán)重影響患者的身心健康、人際關(guān)系和經(jīng)濟(jì)狀況。

最廣泛接受的子宮內(nèi)膜異位癥理論是子宮內(nèi)膜組織的逆行月經(jīng)通過(guò)通暢的輸卵管進(jìn)入腹膜腔。5,6 因此，腹膜腔內(nèi)脫落的子宮內(nèi)膜病變的存活能力對(duì)于建立可行的植入物至關(guān)重要。據(jù)報(bào)道，子宮內(nèi)膜異位癥的遺傳特征在臨床上得到證實(shí)，有病史的家族中子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生率遠(yuǎn)高于未受影響的女性。 7,8 另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位子宮內(nèi)膜有幾種與正常女性相比，基因組發(fā)生了改變。 9,10 此外，在位子宮內(nèi)膜中發(fā)現(xiàn)異常的孕酮受體 (PR) 表達(dá)和孕激素抵抗，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性受損。 11,12 這些發(fā)現(xiàn)表明，女性在位子宮內(nèi)膜的基因組異常子宮內(nèi)膜異位癥可能導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥患者不孕并形成子宮內(nèi)膜異位癥病變。因此，關(guān)注在位子宮內(nèi)膜異常的研究對(duì)于揭示子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。

原代子宮內(nèi)膜細(xì)胞是研究子宮內(nèi)膜異位癥必不可少的工具，但原代細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中往往會(huì)發(fā)生去分化，包括激素和細(xì)胞因子反應(yīng)性的喪失、壽命短、遷移和侵襲的變化。因此，始終如一地供應(yīng)具有穩(wěn)定特性和長(zhǎng)壽命的細(xì)胞對(duì)于研究應(yīng)用非常重要。該研究建立并表征了在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)中保持原始形態(tài)的永生化細(xì)胞，并且生長(zhǎng)速率、流動(dòng)性和上皮間充質(zhì)蛋白、雌激素/孕激素受體表達(dá)保持不變。觀(guān)察到iheESCs的雌激素刺激和炎癥反應(yīng)。綜上所述，iheESCs 可作為體外細(xì)胞模型來(lái)研究在位子宮內(nèi)膜的異常和子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制。

研究?jī)?nèi)容

1.通過(guò)感染慢病毒建立iheESCs

為了產(chǎn)生具有 hTERT 過(guò)表達(dá)的永生化細(xì)胞，慢病毒被包裝并用于感染在位子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞。如圖 1A 所示，iheESCs 在第 5、15、25 和 35 段中穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白 (RFP)。 hTERT 的 mRNA 和蛋白質(zhì)在 iheESCs 中顯著增加(圖 1B，C)。與原代細(xì)胞相比，iheESCs 的形態(tài)沒(méi)有變化(圖 1D)。此外，iheESCs 可以傳代到 42 代，比原代細(xì)胞長(zhǎng)得多(圖 1E)。

圖1.通過(guò)感染慢病毒建立永生化的人類(lèi)在位子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞 (iheESCs)。 (A) 原代基質(zhì)細(xì)胞被帶有紅色熒光蛋白標(biāo)簽的慢病毒感染。 慢病毒感染后 hTERT mRNA (B) 和蛋白 (C) 的表達(dá)。 (D) 原代細(xì)胞和 iheESCs 的細(xì)胞形態(tài)。 (E) 通過(guò)連續(xù)培養(yǎng)處理的原代細(xì)胞和 iheESCs 的壽命。 數(shù)據(jù)代表平均值±SEM。 **P < .001, ***P < .0001。

2. iheESCs 的細(xì)胞生理學(xué)保持不變

為了進(jìn)一步監(jiān)測(cè) iheESCs 的生理變化，檢查了 iheESCs 的生長(zhǎng)和流動(dòng)性。原代細(xì)胞和 iheESCs 的生長(zhǎng)曲線(xiàn)沒(méi)有顯著差異(圖 2A)。 iheESCs 的遷移和侵襲都與原代細(xì)胞相似(圖 2B，C)。此外，雌激素受體、孕激素受體和上皮間充質(zhì)標(biāo)記蛋白在原代細(xì)胞和 iheESCs 之間的表達(dá)是一致的(圖 2D)。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期培養(yǎng)，iheESCs 中 ERs 和 PR 的 mRNA 表達(dá)與原代在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞相比保持不變，這與正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞不同(圖 S1A-C)。為了區(qū)分上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞，使用免疫細(xì)胞化學(xué)分析細(xì)胞角蛋白 18 和波形蛋白的表達(dá)。 iheESCs 和初級(jí)保持較高水平的波形蛋白，而細(xì)胞角蛋白 18 的表達(dá)較低(圖 2E)。為了進(jìn)一步研究細(xì)胞是否被轉(zhuǎn)化，進(jìn)行核型分析以探索iheESCs的染色體情況如圖 2F，iheESCs 維持 23 對(duì)染色質(zhì)，表明 iheESCs 的核型保持正常。這些結(jié)果表明，iheESCs保持了原有的增殖和遷移能力，原代基質(zhì)細(xì)胞的特性和雌孕激素受體的表達(dá)沒(méi)有改變。

圖2. iheESCs 的細(xì)胞生理學(xué)沒(méi)有改變。 (A) 通過(guò) CCK8 測(cè)定每 24 小時(shí)測(cè)定一次原代細(xì)胞和 iheESCs 的增殖。 (B) 通過(guò) transwell 測(cè)定和量化分析評(píng)估的初級(jí) ells 和 iheESCs 的遷移(右)。 (C) 原代細(xì)胞的侵襲測(cè)定和 iheESCs 量化分析 (右)。 (D) EMT 標(biāo)志物、雌激素和孕激素受體在不同細(xì)胞中的表達(dá)。 (E) 通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)評(píng)估上皮和間充質(zhì)細(xì)胞的鑒定。 (F) iheESCs 的染色體核型分析和分選結(jié)果(下)。 數(shù)據(jù)代表平均值±SEM。 NS>0.05，*P < .01。

3. iheESCs 蛻膜化的誘導(dǎo)

為了進(jìn)一步確認(rèn) iheESCs 的蛻膜能力，使用 1 μM 孕酮和 0.1 mM cAMP 刺激 iheESCs 以誘導(dǎo)蛻膜化。 iheESCs 的形態(tài)從紡錘形變?yōu)樨S滿(mǎn)的圓形(圖 3A)。此外，IGFBP-1 和 PRL 的 mRNA 表達(dá)顯著增加(圖 3B，C)。因此，iheESCs 在黃體tong和 cAMP 的刺激下表現(xiàn)出足夠的蛻膜表型。

4. 在 iheESCs 中檢測(cè)到正常的雌激素應(yīng)激和炎癥反應(yīng)證實(shí)雌激素對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用

進(jìn)行iheESCs、CCK8和EdU測(cè)定以檢查增殖和細(xì)胞分裂。如圖 4A 所示，iheESCs 的增殖隨著雌激素的刺激而顯著升高。在雌激素處理的細(xì)胞中，EdU 陽(yáng)性細(xì)胞的百分比顯著增加(圖 4B)。此外, 雌激素處理的 iheESCs 更有能力遷移和入侵 (圖 4C, D)。這些結(jié)果表明正常的雌激素應(yīng)激反應(yīng)在iheESCs中呈現(xiàn)穩(wěn)定。為了檢查iheESCs是否保持正常的炎癥過(guò)程，采用qRT-PCR和Western印跡來(lái)測(cè)量LPS處理的iheESCs中IL-1β和IL-6的表達(dá)。 LPS 刺激增加了 IL-1β 和 IL-6 的 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)(圖 4E，F(xiàn))。這些結(jié)果表明iheESCs保持正常的炎癥反應(yīng)。

5. iheESCs 不具備致瘤能力

為了進(jìn)一步鑒定iheESCs的致瘤能力，采用集落形成試驗(yàn)和裸鼠致瘤性試驗(yàn)來(lái)解決iheESCs的致癌性。圖 5A 的結(jié)果表明，原代細(xì)胞和 iheESCs 的集落形成相似且明顯少于 Ishikawa 細(xì)胞。為了檢查iheESCs是否惡化并獲得致癌能力，將細(xì)胞注射到BALB/c裸鼠體內(nèi)。原代細(xì)胞和 iheESCs 無(wú)法觸發(fā)腫瘤形成，但陽(yáng)性對(duì)照 Ishikawa 細(xì)胞成功形成腫瘤(圖 5B)。因此，這些結(jié)果暗示 iheESC 不具備致瘤能力

圖3. iheESCs 蛻膜化的誘導(dǎo)。 (A) 用progesterone和 cAMP 處理觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)。 (B) 蛻膜誘導(dǎo)后 IGFBP1 mRNA 的水平。 (C) 通過(guò) qRT-PCR 分析的 PRL mRNA 的表達(dá)。 數(shù)據(jù)代表平均值±SEM。 ***P < .0001。

圖4. 在 iheESCs 中發(fā)現(xiàn)了正常的雌激素應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。 (A) 在雌激素刺激下 iheESCs 的增殖。 (B) EdU 檢測(cè)用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞分裂和量化分析(右)。 (C)通過(guò)transwell檢測(cè)和定量分析(右)檢測(cè)到雌激素處理后的細(xì)胞遷移能力。 (D) 評(píng)估暴露于雌激素的細(xì)胞侵襲和定量分析 (右)。 (E) 脂多糖 (LPS) 處理后 IL-1β 和 IL-6 mRNA 的相對(duì)表達(dá)。 (F) 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè) IL-1β 和 IL-6 的蛋白質(zhì)水平。 數(shù)據(jù)代表平均值±SEM。 **P < .001, ***P < .0001。

圖5. iheESCs 不具備致瘤能力。 (A) 用于評(píng)估 iheESCs 致癌潛力的集落形成試驗(yàn)。 (B) 進(jìn)行裸鼠致瘤性測(cè)定以評(píng)估 iheESCs 的致瘤能力

結(jié)論與討論

在這項(xiàng)研究中，我們通過(guò)轉(zhuǎn)染編碼 hTERT 的慢病毒載體建立并表征了永生化的人類(lèi)子宮內(nèi)膜異位癥在位基質(zhì)細(xì)胞 (iheESCs)。 iheESCs 維持 hTERT 的高表達(dá)，在連續(xù)培養(yǎng) 42 代時(shí)保持原始形態(tài)。 iheESCs中雌激素/孕激素受體和EMT標(biāo)志物的表達(dá)與原代細(xì)胞保持穩(wěn)定一致。此外，iheESCs 保持正常生長(zhǎng)和遷移和侵襲能力。 iheESCs 表現(xiàn)出由progesterone和 cAMP 誘導(dǎo)的蛻膜化能力。在iheESCs中檢測(cè)到正常的雌激素和炎癥反應(yīng)。此外，iheESCs 不具備致瘤能力。因此，iheESCs可以成為研究子宮內(nèi)膜異常和子宮內(nèi)膜異位癥病理的理想工具細(xì)胞。

子宮內(nèi)膜與正常和子宮內(nèi)膜異位癥女性之間存在許多巨大差異。與正常子宮內(nèi)膜相比，在位子宮內(nèi)膜的增殖增加。13-15 與正常子宮內(nèi)膜相比，在位子宮內(nèi)膜具有更高的遷移和侵襲能力。16,17 我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，在位細(xì)胞中 EMT 水平顯著提高。 18 因此，在位子宮內(nèi)膜的高增殖、流動(dòng)性和 EMT 可能與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。通過(guò)轉(zhuǎn)染 hTERT 建立的 iheESCs 保留了原始的生長(zhǎng)速率、移動(dòng)性和 EMT 水平。此外，iheESCs 在多代后仍保持間充質(zhì)細(xì)胞的特征。這些結(jié)果表明iheESCs的細(xì)胞生理沒(méi)有退化。因此，在子宮內(nèi)膜異位癥病理學(xué)研究中，使用iheESCs作為模型細(xì)胞替代原代細(xì)胞是可行的。

子宮內(nèi)膜是動(dòng)態(tài)的類(lèi)固醇反應(yīng)組織，它經(jīng)歷重復(fù)的生理周期，包括連續(xù)的增殖、分化、分解和修復(fù)，所有這些都與類(lèi)固醇激素有關(guān)。 19 孕酮及其受體調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的蛻膜化。 20 iheESCs 的蛻膜化被誘導(dǎo)progesterone和cAMP，這表明iheESCs的生理仍然受到progesterone的深度調(diào)節(jié)。此外，該iheESCs中的蛻膜化表明iheESCs可用于子宮內(nèi)膜容受性和胚胎植入的研究。另一方面，與炎癥相互作用的雌激素在維持子宮內(nèi)膜異位癥中起著至關(guān)重要的作用。 21,22 我們之前的研究發(fā)現(xiàn)，雌激素通過(guò) p38 上調(diào)細(xì)胞生長(zhǎng)、流動(dòng)性和 EMT 水平上述測(cè)定表明，iheESCs 的生長(zhǎng)和遷移受雌激素的調(diào)節(jié)，因此 iheESCs 的細(xì)胞活性受雌激素的影響。此外，在 iheESCs 中檢測(cè)到對(duì) LPS 誘導(dǎo)的炎癥的反應(yīng)。因此，iheESCs可作為模型細(xì)胞系研究雌激素和炎癥過(guò)程對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的影響和機(jī)制。

此外，其他小組通過(guò)使用各種方法使細(xì)胞永生化，克服了原代培養(yǎng)的局限性。 Yuhki 等人 24 建立了人類(lèi)永生化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞系 KC02-44D，它保持正常的蛻膜能力和炎癥反應(yīng)。 Holdsworth 等人 25 報(bào)道，永生化的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞系保持純合子宮內(nèi)膜異位癥風(fēng)險(xiǎn)基因型和對(duì)激素(增殖和蛻膜變化)和炎癥的不同反應(yīng)。與保持原發(fā)性激素反應(yīng)和炎癥的 hTERT 永生化子宮內(nèi)膜細(xì)胞相同，iheESCs 保持較長(zhǎng)的細(xì)胞壽命，可達(dá) 40 代。進(jìn)一步觀(guān)察到 iheESCs 的流動(dòng)性和 EMT 水平?jīng)]有變化。此外，iheESCs 是不完全轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，沒(méi)有惡性轉(zhuǎn)化。因此，iheESCs在更廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域提供更長(zhǎng)的使用壽命，并保證應(yīng)用安全。

建立永生化細(xì)胞的過(guò)程可能導(dǎo)致細(xì)胞退化，從而獲得致瘤能力。然而，iheESCs 不具備致瘤能力并保持原代細(xì)胞的生長(zhǎng)特性。因此，我們的研究結(jié)果表明，iheESCs保持穩(wěn)定的特性和應(yīng)激反應(yīng)，可作為研究在位子宮內(nèi)膜異常和子宮內(nèi)膜異位癥病理的理想細(xì)胞模型。