永生化小鼠胸腺上皮細(xì)胞的鑒定及功能研究

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文章摘要

胸腺上皮細(xì)胞（TEC）作為胸腺內(nèi)三維支架中的關(guān)鍵細(xì)胞，通過粘連性內(nèi)切和各種細(xì)胞因子的釋放，在T細(xì)胞前體的歸巢，遷移和分化中起著關(guān)鍵作用。在這項(xiàng)研究中，分離小鼠TEC的原代培養(yǎng)物，并用TEC-specific抗體CK5和CK8進(jìn)行鑒定。這些TEC通過猿猴病毒（SV）40大T抗原的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)而永生化。然后，我們比較了TEC和永生化TEC（iTEC）的功能。通過倒置顯微鏡攝影和傳代后結(jié)晶紫測定法觀察了TECs和iTEC的細(xì)胞形態(tài)和增殖能力。然后進(jìn)行軟瓊脂測定以觀察其克隆形成能力。采用IF和qPCR檢測IL-7、Lptin、Pax-9、Sema3A等上皮細(xì)胞相關(guān)因子的表達(dá)水平。將TEC與人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞（THP-1）共培養(yǎng)，并用flow細(xì)胞術(shù)和CFSE標(biāo)記觀察TECs對促進(jìn)THP-1增殖的影響。測量衰老相關(guān)的b-半乳糖酶-dase測定以檢測細(xì)胞的抗衰老能力。通過碘化丙啶（PI）染色分析細(xì)胞周期分布，通過膜聯(lián)蛋白V-PI染色檢測d紫杉醇（PTX）誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，以評價(jià)細(xì)胞的抗凋亡能力�？v觀本文，我們發(fā)現(xiàn)永生化的TEC仍然保留了原代TEC的特征，如形態(tài)、功能和上皮特征;然而，iTEC在增殖和抗衰老方面具有更強(qiáng)的能力。研究表明，iTEC被SV40大T抗原成功永生化，iTEC的生物學(xué)特征和功能與原始TEC相似。這種永生化細(xì)胞可用作胸腺功能研究的應(yīng)急細(xì)胞模型，用iTEC替代原代TEC。

研究背景

作為T細(xì)胞發(fā)育的主要器官，胸腺在產(chǎn)生具有自身耐受適應(yīng)性免疫功能的成熟T細(xì)胞中起著關(guān)鍵作用。T細(xì)胞能夠識(shí)別自身主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子，并在胸腺中進(jìn)行負(fù)選擇后能夠區(qū)分自身抗原和非自身抗原。

胸腺由兩個(gè)功能區(qū)室組成，即髓質(zhì)和皮層。TEC是兩個(gè)隔間中的關(guān)鍵單元。TECs和發(fā)育中的胸腺細(xì)胞之間的相互作用是復(fù)雜的三維上皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)發(fā)育的關(guān)鍵過程，也是胸腺細(xì)胞在兩個(gè)胸腺區(qū)室正常發(fā)育中的分化和成熟的關(guān)鍵過程。在此期間，TECs分泌的因子起著關(guān)鍵作用。對胸腺生物學(xué)認(rèn)識(shí)的最新進(jìn)展表明，TECs的復(fù)雜三維網(wǎng)絡(luò)以及胸腺細(xì)胞和上皮細(xì)胞之間的相互作用對于維持正常的胸腺功能至關(guān)重要。人類T細(xì)胞發(fā)育的研究需要強(qiáng)大的模型系統(tǒng)來概括胸腺生成的整個(gè)跨度。因此，大量研究致力于構(gòu)建三維細(xì)胞模型或人工胸腺類器官(ATO)系統(tǒng)，用于研究胸腺中人類T細(xì)胞從造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(HSPC)中的選擇和成熟。通過成熟的T細(xì)胞。

然而，由于缺乏公認(rèn)的TEC細(xì)胞系，這些系統(tǒng)顯示出很高的實(shí)驗(yàn)變異性。培養(yǎng)的原代TECs的體外復(fù)制壽命有限，限制了在細(xì)胞水平上對胸腺功能的研究。缺乏穩(wěn)定和公認(rèn)的胸腺細(xì)胞模型嚴(yán)重限制了在細(xì)胞水平上對胸腺細(xì)胞和TECs之間相互作用的研究。因此，延伸一條永生化TECs（iTECs）線是非常有意義的。

SV40T是一種病毒蛋白，可促進(jìn)端粒酶的活化并介導(dǎo)生長抑制劑的失活[6]。多項(xiàng)研究表明，將SV40T病毒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中可以使不同類型的細(xì)胞類型永生化，例如犬附睪細(xì)胞系[7]、人肝星狀細(xì)胞系[8]和豬結(jié)腸上皮細(xì)胞系[9]。本研究的目的是利用SV40T病毒建立iTEC模型，并觀察細(xì)胞特性和功能的變化[10]。它有助于為研究人類T細(xì)胞發(fā)育和基于干細(xì)胞的體外工程T細(xì)胞療法方法提供穩(wěn)定的工具。

研究內(nèi)容

1．iTECs表達(dá)上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物CK5和CK8

通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將異源基因SV40T轉(zhuǎn)移到TECs中。用4mg/mL潮霉素篩選后，體外培養(yǎng)陽性細(xì)胞。觀察到的細(xì)胞狀態(tài)良好，形態(tài)穩(wěn)定。PCR結(jié)果顯示，iTECs組在500bp左右有一條亮帶，與預(yù)期的目標(biāo)片段位置476bp和TECs中未顯示的目標(biāo)帶一致（圖1A）。結(jié)果表明，外源基因SV40T已成功整合到TECs基因組中。TECs和iTECs的免疫熒光染色顯示它們均表達(dá)上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物CK5和CK8。TECs和iTECs的典型細(xì)胞質(zhì)和核染色結(jié)果如圖2A所示。表明分離的細(xì)胞確實(shí)是胸腺上皮細(xì)胞，成功地永生化，并保留了原代TECs的上皮特性。

2.iTECs表現(xiàn)出高增殖和克隆形成活性

結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)表明TECs和iTECs組的細(xì)胞數(shù)量在傳代后d1時(shí)是相同的。傳代到d4后，iTEC組的細(xì)胞明顯增多，這意味著iTECs的增殖率明顯高于TECs（圖1C）。此外，兩種細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)也不同：TECs呈規(guī)則的橢圓形，細(xì)胞觸角短，生長集中致密，而iTECs呈明顯的梭形，細(xì)胞分散且獨(dú)立生長（圖1）。1D)。結(jié)果類似于Toouli等人的結(jié)果[17]。軟瓊脂上的集落形成結(jié)果表明TECs和iTECs都可以形成細(xì)胞集落。菌落直徑

iTEC中200mm占iTEC組總菌落的59.52±14.14%，而TEC組僅占11.67±3.50%（圖1B）。細(xì)胞周期結(jié)果顯示，TECs中G0/G1、G2/M和S細(xì)胞的比例分別為36.83±1.96%、18.43±5.81%和45.44±5.63%，而各時(shí)期iTECs的比例為27.99±2.52%和16.11±6.34%、54.40±8.0%（圖3A）。結(jié)果表明，永生化后TECs的形態(tài)發(fā)生了變化。iTECs的細(xì)胞增殖和克隆形成能力高于TECs。

3.iTECs更能耐受DNA損傷和老化

為了評估TECs和iTECs對DNA損傷的反應(yīng)是否不同，每個(gè)細(xì)胞系都暴露于DNA嵌入劑PTX。ANNIXIN-V-FITC/PI雙染結(jié)果顯示，TECs-Control組、TECs-PTX組、iTECs-Control組和iTECs-PTX組細(xì)胞凋亡率分別為16.70±3.70%、22.34±4.21%、9.92±2.79%和16.50±3.65%（圖3B）。值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3。結(jié)果表明iTECs對PTX誘導(dǎo)的DNA損傷更耐受。細(xì)胞衰老是機(jī)體抑制腫瘤的一種機(jī)制，也是衰老的原因之一。老化細(xì)胞表現(xiàn)出與衰老相關(guān)的b-半乳糖苷酶(SA-b-半乳糖苷酶)染色呈綠色陽性，并顯示扁平細(xì)胞形態(tài)[18]。結(jié)果表明，當(dāng)TECs和iTECs都在第3位時(shí)

傳代后，TECs和iTECs中陽性細(xì)胞（衰老細(xì)胞）的比例分別為5.49%和5.81%（圖3Ca和3Cc）。當(dāng)TECs傳到第6代時(shí)，陽性細(xì)胞率為45.04%。相比之下，iTECs在第12代時(shí)，陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞形態(tài)呈扁平狀（圖3Cb和3Cd）。結(jié)果表明，與TECs相比，iTECs具有更快的分裂增殖能力和更強(qiáng)的抗衰老能力。

4.iTECs表達(dá)TEC標(biāo)記和相關(guān)因子

我們?nèi)�面檢測了TECs增殖、分化和激活過程中關(guān)鍵因子的表達(dá)水平，包括TNF-a、IL-1b、IL-7、Sema-3A、Leptin、ACTH、FGFR2IIIb、Foxn1及其下游基因Pax9.半定量RT-PCR（qPCR）結(jié)果顯示TECs和iTECs分泌的上述細(xì)胞因子的表達(dá)水平相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2B）。結(jié)果證實(shí)，永生化后胸腺上皮細(xì)胞的上皮功能沒有明顯變化。

5.iTECs和TECs對THP-1增殖表現(xiàn)出相似的促進(jìn)作用

CFSE染色的THP-1細(xì)胞與TECs或iTECs共培養(yǎng)48h，流式細(xì)胞儀檢測THP-1細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，對照組、TECs組和iTECs組THP-1在親本組中的比例分別為66.09±3.55%、54.51±7.18%和53.25±7.39%。與Control組相比，TEC組和iTEC組母體細(xì)胞比例降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）；然而，TEC組和iTEC組之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4A）。

圖1.(A)PCRAssay的凝膠電泳檢測TECs和iTECs中的SV40T。M：600bp梯形圖，TECs(1)和iTECs(2)的GAPDH，3：TECs(3)和iTECs(4)的SV40T。(B)TECs和iTECs在軟瓊脂中的菌落生長能力。(C)結(jié)晶紫染色法測定細(xì)胞活力和增殖。細(xì)胞在所描述的指定時(shí)間點(diǎn)用結(jié)晶紫染色。(D)相同通道的原代和永生化小鼠胸腺上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)。（有關(guān)此圖例中顏色參考的解釋，請讀者參考本文的網(wǎng)絡(luò)版本。）

圖2.(A)iTECs表達(dá)與TECs相同的上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物。DAPI（藍(lán)色）、CK5（紅色）和CK8（綠色）以及TECsGroup和iTECsGroup的合并圖像；照片是在放大400倍的顯微鏡下拍攝的。(B)條形圖表示TECs和iTECs中TNF-a、IL-1b、IL-7、Sema3A、Leptin、ACTH、FGFR2IIIb、Foxn1和Pax9mRNAs的相對表達(dá)(平均值±S.E.M.)。數(shù)據(jù)來自三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。（有關(guān)此圖例中顏色參考的解釋，請讀者參考本文的網(wǎng)絡(luò)版本。）

圖3.(A)TECs和iTECs的細(xì)胞周期率。(B)PTX對TECs和iTECs凋亡率的影響。(C)在第3代(a)和第6代(b)的TECs組和第3代(c)和第12代(d)的iTECs組中進(jìn)行衰老相關(guān)的b-gal染色。黑色箭頭指向藍(lán)色染色的細(xì)胞。。

圖4.CSFE染色用于測試TECs和iTECs對THP-1細(xì)胞增殖的影響。數(shù)據(jù)代表母細(xì)胞率(%)和平均值±SE,n=3。

結(jié)論與討論

關(guān)于胸腺功能，TECs是研究的主要細(xì)胞類型之一，因此在免疫學(xué)基礎(chǔ)研究中引起了極大的關(guān)注�？赡娴�SV40T介導(dǎo)的永生化策略賦​​予TECs無限的文化壽命，對TECs的應(yīng)用具有重要意義。作為建立永生化細(xì)胞系最常用的方法，由SV40編碼的大T抗原在感染從有限組織來源分離的允許細(xì)胞導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化中起重要作用。在我們的研究中，SV40LT-SSR69質(zhì)粒被用來感染原代TECs，因此，永生化的TECs附著在培養(yǎng)皿底部，可以連續(xù)傳遞。iTECs生長更快并保持較高的增殖率（圖1C）。事實(shí)上，iTEC到現(xiàn)在已經(jīng)傳了超過45代，并且增殖良好。iTECs的細(xì)胞形態(tài)等基本特征與TECs相似，iTECs具有上皮細(xì)胞的生長特征。IF結(jié)果顯示iTECs仍​​表達(dá)CK5和CK8，從而保留了TECs的上皮功能。

細(xì)胞周期分析、細(xì)胞凋亡分析和軟瓊脂集落形成分析結(jié)果也表明，iTECs的增殖和存活率優(yōu)于TECs。TECsS期細(xì)胞為45.44±5.63%，低于iTECs54.40±8.0%，TECsG0/G1期細(xì)胞百分比顯著高于iTECs。PTX誘導(dǎo)的正常TECs的凋亡率也高于iTECs。TECs和iTECs都可以在軟瓊脂培養(yǎng)基中生長，但無論克隆的數(shù)量或大小如何，iTECs都具有更顯著的克隆形成能力。永生化可以延長TEC在培養(yǎng)條件下的細(xì)胞壽命。我們檢測到了生物標(biāo)志物“衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶”（SA-b-gal），

這可以方便地在體外識(shí)別單個(gè)衰老細(xì)胞。β-半乳糖苷酶是一種穩(wěn)定的酶，廣泛存在于體外和體內(nèi)不同來源的衰老細(xì)胞中[19]。衰老和永生化細(xì)胞群中的半乳糖苷酶活性表明，在TECs中SA-b-gal染色細(xì)胞（細(xì)胞質(zhì)被染成綠色）的陽性百分比較高。

TECs通過分泌不同種類的細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的正向和負(fù)向選擇。TNF-α是一種多效性細(xì)胞因子，在胸腺中組成型表達(dá)[20]。白細(xì)胞介素(IL)-7是T淋巴細(xì)胞發(fā)育和體內(nèi)平衡所必需的細(xì)胞因子[21]，而白細(xì)胞介素1β(IL-1b)主要來源于免疫細(xì)胞[2,22]。軸突排斥因子Sema3A參與胸腺中的許多細(xì)胞過程，包括胸腺細(xì)胞的粘附和遷移[23-25]。激素因子（如瘦素，至少在一定程度上通過激素對T細(xì)胞的直接作用來調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫[26,27]，促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)在調(diào)節(jié)胸腺增大中起核心作用，對活化的體外人類B細(xì)胞[33,34])。Forkhead-box轉(zhuǎn)錄因子n1(Foxn1)及其下游配對盒基因9(Pax9)調(diào)節(jié)TEC分化并驅(qū)動(dòng)未成熟上皮細(xì)胞分化為功能性cTECs和mTECs[28-30]。成纖維細(xì)胞生長因子受體2IIIb(FGFR2IIIb)信號(hào)傳導(dǎo)對胸腺上皮增殖至關(guān)重要[31,32]。在這項(xiàng)研究中，它們在TEC和iTECs中都以相同的水平表達(dá)。

總之，永生化TECs的生物學(xué)特性和功能與原始TECs的生物學(xué)特性和功能沒有顯著差異，我們的研究表明，永生化可以延長TECs的體外培養(yǎng)時(shí)間。iMHCs仍具有正常TECs的分泌功能，可促進(jìn)單核細(xì)胞的增殖。本研究為研究胸腺和胸腺細(xì)胞發(fā)育和體外功能提供了另一種細(xì)胞模型。