最初養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)候看著師兄全副武裝進(jìn)入細(xì)胞房是一件很神圣的事情。。。
時(shí)間長(zhǎng)了才發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)細(xì)胞是一件痛苦并快樂的事情，要像對(duì)待小baby一樣照顧它、呵護(hù)它，細(xì)胞長(zhǎng)的好心情就會(huì)像飛起來，細(xì)胞出現(xiàn)一點(diǎn)點(diǎn)狀況，心情就會(huì)跌入谷底。下面將小編多年養(yǎng)細(xì)胞的經(jīng)驗(yàn)、心得與注意事項(xiàng)與大家交流一下。
一般來說，影響細(xì)胞培養(yǎng)的因素有很多，下面我們分為幾個(gè)小專題和大家分享一下。
1.血清篇2.添加劑篇3.細(xì)胞傳代篇
4.細(xì)胞凍存篇5.細(xì)胞污染篇6.原代細(xì)胞篇
血清篇
血清的熱滅活：
滅活方法：56℃滅活30min。滅活后，血清的外觀會(huì)發(fā)生變化，沉淀物顯著增多。熱滅活主要是滅活補(bǔ)體系統(tǒng)，因?yàn)榧せ畹难a(bǔ)體系統(tǒng)會(huì)激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。原代細(xì)胞和免疫細(xì)胞建議熱滅活血清。
血清的沉淀：
血清沉淀主要是血清中的各種蛋白、磷酸鈣和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白、玻連蛋白等）引起，不會(huì)影響血清質(zhì)量，使用時(shí)可以2000rpm
離心5分鐘，取上清使用。
可能會(huì)增加血清沉淀的操作：1、熱滅活；2、37℃培養(yǎng)；3、反復(fù)凍融；4、伽馬射線照射；5、2-8℃長(zhǎng)期保存；6、長(zhǎng)期保存于可自動(dòng)化霜的冰箱中（溫度不穩(wěn)定）。
血清保存：
建議血清保存于-20℃冰箱中，分裝使用，如果存放在4℃，請(qǐng)勿超過一個(gè)月。
血清的選擇：
血清為細(xì)胞的繁殖提供必須的生長(zhǎng)因子，同時(shí)也是礦物質(zhì)、脂類及激素的來源。最常用的血清有小牛血清、新生牛血清、胎牛血清和馬血清等。牛血清是按照采血時(shí)間的早晚來分類的。采血時(shí)間越早，營養(yǎng)物質(zhì)越豐富，所含抗體也越少，因而胎牛血清適合要求高的細(xì)胞系和克隆化培養(yǎng)。 血清批次間的差別是不可避免的，建議您一旦選定了某個(gè)批次的血清，最好備貨，避免以后的麻煩。
添加劑篇
平衡鹽溶液
平衡鹽溶液主要是由無機(jī)鹽、葡萄糖組成；它的作用是維持細(xì)胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡(jiǎn)單的營養(yǎng)；同時(shí)用于取材時(shí)組織塊的漂洗、細(xì)胞的漂洗、配制其他試劑等。
PBS磷酸鹽緩沖液： (Phosphate-Buffered Saline)，含135mM NaCl, 4.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 2mM NaH2PO4，pH值為7.4，經(jīng)過滅菌處理。
用途：用于細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞的洗滌或其他常規(guī)用途。
D-PBS：D-PBS溶液(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)，含2.67mM KCl, 1.47mM KH2PO4, 137.93mM NaCl, 8.06mM Na2HPO4，pH值為7.4，經(jīng)過滅菌處理。
用途：不含鈣、鎂離子，多用于胚胎學(xué)方面的研究，常用于胚胎的沖洗液，凍存液和培養(yǎng)液。
Hank’s平衡鹽：Hanks' Balanced Salt Solution，簡(jiǎn)稱HBSS，含137.93mM NaCl, 5.33mM KCl, 4.17mM NaHCO3, 0.441mM KH2PO4, 0.338mM Na2HPO4, 5.56mM D-Glucose。經(jīng)過無菌處理。
用途：可用于在大氣環(huán)境下維持細(xì)胞生理 pH 的緩沖液，用于細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞的洗滌等常規(guī)用途。
緩沖液
絕大多數(shù)細(xì)胞的最佳生長(zhǎng)條件是pH 6.8-7.8。多數(shù)培養(yǎng)基利用碳酸氫鈉進(jìn)行緩沖，碳酸氫鈉的緩沖需要二氧化碳。 NaHCO3溶液：7.5% NaHCO3溶液(Sodium Bicarbonate Solutioin)用水配制，已經(jīng)過過濾除菌。
用途：常用于細(xì)胞培養(yǎng)過程中調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值。
細(xì)胞傳代篇
胰酶消化細(xì)胞：
a.吸去培養(yǎng)液，用無菌的PBS、Hanks液或無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞一次，以去除殘余的血清。
b.加入少量胰酶細(xì)胞消化液，略蓋過細(xì)胞即可，室溫放置30秒至2分鐘。不同的細(xì)胞消化時(shí)間有所不同。
c.顯微鏡下觀察，細(xì)胞明顯收縮，并且肉眼觀察培養(yǎng)器皿底部發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯的變化；或者用槍吹打細(xì)胞發(fā)現(xiàn)細(xì)胞剛好可以被吹打下來。此時(shí)吸除胰酶細(xì)胞消化液。加入含血清的完全細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下細(xì)胞，即可直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
d.如果發(fā)現(xiàn)消化不足，則加入胰酶細(xì)胞消化液重新消化。
如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞消化時(shí)間過長(zhǎng)，未及吹打細(xì)胞，細(xì)胞已經(jīng)有部分直接從培養(yǎng)器皿底部脫落，直接用胰酶細(xì)胞消化液把細(xì)胞全部吹打下來。1000-2000g離心1分鐘，沉淀細(xì)胞，盡量去除胰酶細(xì)胞消化液后，加入含血清的完全培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
對(duì)于比較難消化的細(xì)胞，比如結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116，HCT15，KM12，這些細(xì)胞一般需要少量的胰酶孵育，以恰好覆蓋細(xì)胞為宜，時(shí)間在5min左右，細(xì)胞呈流沙狀移動(dòng)，即可終止消化。對(duì)于難消化的細(xì)胞，一般在trypsin中添加一些EDTA。
細(xì)胞凍存篇
細(xì)胞凍存遵守慢凍速融原則。細(xì)胞在凍存時(shí)，細(xì)胞冷到0℃以下，細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞中形成冰晶，大的冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂，因此需要慢凍，防止大的冰晶產(chǎn)生；快融是防止小冰晶重結(jié)晶形成大冰晶。常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，使水滲透到細(xì)胞外形成冰晶。細(xì)胞凍存液主要成分是高糖DMEM、適量澳洲進(jìn)口優(yōu)質(zhì)胎牛血清及DMSO。
細(xì)胞凍存步驟：胰酶消化細(xì)胞--吹打成細(xì)胞懸液--離心獲取細(xì)胞沉淀--添加凍存液--程序性降溫凍存細(xì)胞--做好凍存記錄。
注意事項(xiàng)：1、0至-60℃是低溫?fù)p傷發(fā)生的主要溫度范圍，被稱為“危險(xiǎn)溫區(qū)”，細(xì)胞短暫放置后應(yīng)立刻轉(zhuǎn)移到-80℃，長(zhǎng)期保存需要轉(zhuǎn)移到液氮罐中，并定期檢查液氮罐，及時(shí)添加。
細(xì)胞污染篇
養(yǎng)細(xì)胞最頭痛的就是遇到污染問題，總是讓你猝不及防，又無從尋找原因。現(xiàn)整理一些細(xì)胞培養(yǎng)過程中常遇見的污染問題，供君參考。
細(xì)胞污染根據(jù)污染源的不同主要分為3類：化學(xué)性污染、物理性污染和微生物污染，其中微生物污染是最常見也是最嚴(yán)重的，一旦發(fā)生，無法挽救，只能將細(xì)胞丟棄。下面簡(jiǎn)單介紹一下常見的微生物污染。
霉菌污染：霉菌污染種類很多，多為曲霉菌、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。
污染源：實(shí)驗(yàn)人員（實(shí)驗(yàn)服）
霉菌污染后短期內(nèi)不會(huì)引起培養(yǎng)液的渾濁，會(huì)在培養(yǎng)液中形成白色或淡黃色漂浮物，一般肉眼可見，易被發(fā)現(xiàn)。4d左右倒置顯微鏡下可以觀察到縱橫交錯(cuò)的菌絲。
酵母污染更容易觀察，培養(yǎng)物變渾濁，顯微鏡下可以觀察到卵圓形或球形顆粒，散在細(xì)胞上及細(xì)胞周邊生長(zhǎng)，有些會(huì)芽生較小顆粒。
確認(rèn)是霉菌污染后，需要將細(xì)胞直接丟棄，將實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)徹底消毒處理。
細(xì)菌污染：
常見的細(xì)菌污染主要是大腸桿菌、假單胞菌、 葡萄球菌等，其中革蘭陽性菌較為多見。
污染源：操作不當(dāng)或是器材消毒不嚴(yán)，或是各種營養(yǎng)成分隱性污染細(xì)菌沒有被檢測(cè)出來所造成的。
污染速度快，多數(shù)情況下細(xì)胞培養(yǎng)液短時(shí)間內(nèi)變黃，pH值降低，明顯渾濁，倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞漿出現(xiàn)大量顆粒，細(xì)胞變圓或崩潰，從壁上脫落，細(xì)胞培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮，呈細(xì)沙狀，細(xì)胞間可以觀察到菌體存在。必要時(shí)可以取少量培養(yǎng)液接種到細(xì)菌培養(yǎng)板或細(xì)菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)、檢測(cè)。一旦發(fā)生細(xì)菌污染，早期時(shí)可以增大雙抗的使用倍數(shù)，用藥24-48小時(shí)后更換成常規(guī)培養(yǎng)基，污染晚期，細(xì)胞需要棄掉，復(fù)蘇新的細(xì)胞。
支原體污染：
污染源：血清
大小介于細(xì)菌與病毒之間的無細(xì)胞壁的原核細(xì)胞，對(duì)抗生素不敏感，可穿過0.22 μm 的孔徑濾膜，不能用肉眼或光學(xué)顯微鏡檢測(cè)，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中是最容易忽視的一類污染。
支原體污染早期，細(xì)胞沒有明顯的變化，只有污染嚴(yán)重后，細(xì)胞增殖速度降低，細(xì)胞脫落。并且支原體可以通過移液、傾倒液體時(shí)產(chǎn)生具有潛在感染力的飛沫和吸附的塵埃，沉積在物體表面，污染操作環(huán)境，引起交叉感染和再次污染。懷疑支原體污染，可以使用支原體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。
污染較輕時(shí)，使用支原體去除試劑盒進(jìn)行處理
同時(shí)嚴(yán)格清理實(shí)驗(yàn)操作環(huán)境。
ps:從外部獲取的細(xì)胞請(qǐng)記得要進(jìn)行支原體污染檢測(cè)呦！
黑膠蟲污染：
黑膠蟲是學(xué)術(shù)界爭(zhēng)議比較大的一類污染，不能確定是生物還是非生物，可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播。
污染源：血清
開始污染時(shí)對(duì)細(xì)胞無影響，當(dāng)達(dá)到一定數(shù)量時(shí)會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，培養(yǎng)基沒有變化，顯微鏡下可以觀察到點(diǎn)狀或片狀游動(dòng)小體。細(xì)胞增殖旺盛之后會(huì)自然消失，除更換血清外無須特殊處理。
病毒污染：
病毒污染不會(huì)影響細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。
污染源：動(dòng)物血清或者細(xì)胞系，常見于雜交瘤細(xì)胞。
病毒污染極為隱蔽，很難檢測(cè)。細(xì)胞液沒有變化，大多數(shù)受病毒污染的細(xì)胞也不會(huì)產(chǎn)生形態(tài)變化及細(xì)胞病理現(xiàn)象，僅有少部分病毒會(huì)造成細(xì)胞變圓、腫脹，脫落。 懷疑發(fā)生病毒污染可以用血細(xì)胞吸附試驗(yàn)、免疫熒光抗體法及電子顯微鏡法有效檢出病毒。通常病毒污染的清除是十分困難的，可以重新引入高質(zhì)量的細(xì)胞株。
非同種細(xì)胞污染：
即細(xì)胞交叉污染，由于在培養(yǎng)過程中各種細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行，而所用器具或液體混雜使用所致。細(xì)胞發(fā)生交叉污染后由于難以分離細(xì)胞，所以一般是丟棄細(xì)胞，重新獲取實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞。 所以在吸取兩種以上的使用液時(shí)要注意更換吸管，防止交叉污染。
原代細(xì)胞篇
注意事項(xiàng)：
原代細(xì)胞是剛從體內(nèi)取出的組織中獲得的細(xì)胞，要求不嚴(yán)格的話，十代以內(nèi)都算原代細(xì)胞。因?yàn)殡x體時(shí)間短更能接近體內(nèi)狀況，同時(shí)對(duì)體外培養(yǎng)條件更加苛刻，需要更接近體內(nèi)環(huán)境培養(yǎng)條件。
1、計(jì)數(shù)前，注意吸盡平皿里的細(xì)胞，充分混勻，使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞，每次操作只處理一株細(xì)胞，以免造成細(xì)胞交叉污染。
2、原代細(xì)胞未經(jīng)永生化處理，因此群體倍增次數(shù)有限。為了防止遺傳上的變化，最好盡快開始做實(shí)驗(yàn)。另外，為了防止混入雜細(xì)胞比例的增加，要經(jīng)常觀察細(xì)胞形態(tài)。
3、原代細(xì)胞再凍存后，細(xì)胞會(huì)老化，也可能引起機(jī)能變化，所以不建議凍存。細(xì)胞凍存也是細(xì)胞死傷的主要原因。
4、如果DMSO的濃度足夠低，不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成傷害，復(fù)蘇原代細(xì)胞建議用帶有血清的完全培養(yǎng)基溶解后鋪瓶，第二天換液去除DMSO。
5、原代細(xì)胞傳代時(shí)，要用低濃度的胰酶消化，在顯微鏡下看到細(xì)胞開始變圓、脫落后迅速終止胰酶。建議采用含10%血清的完全培養(yǎng)基作為胰酶終止劑終止消化。
