當前位置：首頁>技術資訊
發(fā)布時間：2024/11/20 10:00:47 閱讀次數(shù)：21
一：實驗原理
MSC首先收回其突起，聚集成團這個團中間的細胞經(jīng)分裂分化轉變成一種大而圓的細胞即成軟骨細胞成軟骨細胞產(chǎn)生基質和纖維（主要為II型膠原蛋白），當基質的量增加到一定程度時成軟骨細胞被分隔在陷窩內分化為成熟的軟骨細胞，體外誘導成軟骨分化的鑒定主要圍繞成軟骨的標志物II型膠原蛋白來進行
二：實驗準備
提前準備好將要用到的試劑：細胞基礎培養(yǎng)基、優(yōu)級胎牛血清、阿利新藍染色液、核固紅染色液、間充質干細胞成軟骨誘導分化添加物A、間充質干細胞成軟骨誘導分化添加物B。
配置前6h將優(yōu)級胎牛血清放置于4℃冰箱內完全融化，提前30min將成軟骨誘導分化添加物AB都放置于4℃冰箱內將準備好的試劑移入超凈臺中上下顛倒或輕彈試劑管以混勻試劑，先將優(yōu)級胎牛血清加入細胞基礎培養(yǎng)基中再將成軟骨誘導分化添加物也加入細胞培養(yǎng)基中取少量基礎培養(yǎng)基，洗滌各瓶、管盡可能將所有成分全部加入基礎培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基搖晃混合均勻用封口膜密封瓶口用鋁箔紙包裹瓶身再次用封口膜加固包裝并標注名稱、配制日期等信息。
三：誘導操作
將準備好的裝有細胞的T75瓶從培養(yǎng)箱中取出，顯微鏡下觀測細胞狀態(tài)轉移至超凈臺，吸去上清加入胰蛋白酶消化液至T75瓶中，搖晃均勻置于培養(yǎng)箱中消化3min消化完成后加入含血清培養(yǎng)基，將細胞吹打混勻加入離心管中進行離心準備1000轉離心5min棄去上清加入無血清培養(yǎng)基重懸吹打混勻，提取一些細胞溶液加入臺盼藍進行染色計數(shù)，往六孔板中加入每孔2 mL普通完全培養(yǎng)基將細胞按照2x104cells/cm4的細胞密度接種手六孔板中細胞置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)當細胞融合度達到70%時小心地將孔內完全培養(yǎng)基吸走向六孔板中加入2 mL間充質于細胞成軟骨誘導分化培養(yǎng)基，將六孔板放入培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每隔3天換用新鮮的間充質干細胞成軟骨誘導分化培養(yǎng)基首先吸棄舊的培養(yǎng)基，加入新鮮的成軟骨誘導分化培養(yǎng)基
注意：需待培養(yǎng)基回復室溫，緩慢滴加，誘導2~4周后視細胞的形態(tài)變化及生長情況用阿利辛藍進行染色。
四：染色分析
吸棄孔內成軟骨誘導分化完全培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕柔洗滌2~3次吸棄孔內多余緩沖液每孔加入2mL的4%多聚甲醛溶液（或10%福爾馬林）固定10min以上，吸去固定液，加入PBS輕柔洗滌2~3次確保將固定液清洗徹底，吸棄多余固定液孔內加入1%阿利新藍染色液（pH2.54）室溫染色30min，吸阿利新藍染色液，向里面加入PBS緩沖液，輕柔洗滌2~3次充分洗去染色液，吸棄多余液體加入0.1%核固紅染色液室溫染色5~10min，吸棄孔內染色液使用流水沖洗，吸棄多余液體家兔去離子水浸泡置于顯微鏡下觀察染色效果。
細胞鑒定
軟骨的破壞、缺失是包括骨關節(jié)炎在內的多種骨科疾病的重要病理改變，由于軟骨特殊的解剖及組織特性如缺乏血和淋巴管的分布使得其自我修復能力異常不足，因此通過人工的方法修復軟骨破壞具有重要臨床意義，近年來隨著間充質干細胞的發(fā)現(xiàn)和研究深入其來源廣泛、良好的增殖能力、多分化潛能與各種3D支架材料具有良好的生物相容性等特性，使得其在軟骨修復應用中具有令人期待的潛力。體外誘導軟骨分化鑒定，主要圍繞成軟骨的標志物——II型膠原蛋白來進行，而甲苯胺藍則主要檢測成軟骨細胞內酸性粘多糖。
掃碼咨詢微信客服
掃碼咨詢微信客服
©Copyright 上海雅吉生物科技有限公司 All Rights Reserved. ICP備案號：滬ICP備18032507號-1 技術支持：阿儀網(wǎng)
