將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出,經(jīng)各種酶(常用胰蛋白酶) 螯合劑(常用EDTA)或機(jī)械方法處理,分散成單細(xì)胞,置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),使細(xì)胞得以生存 生長(zhǎng)和繁殖,這一過(guò)程稱原代培養(yǎng).

原代細(xì)胞培養(yǎng)的步驟一股是:取材→分離→培養(yǎng)和維持,今天我們重點(diǎn)介紹原代細(xì)胞的取材和分離方法.

— 取材

人和動(dòng)物細(xì)胞的取材是原代細(xì)胞培養(yǎng)成功的首要條件,直接影響細(xì)胞的體外培養(yǎng).

取材的基本要求:取材要注意新鮮和保鮮應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌

③防止機(jī)械損傷

去除無(wú)用組織和避免干燥應(yīng)注意組織類型 分化程度 年齡等

作好記錄各類組織的取材技術(shù):皮膚和粘膜的取材主要取自于手術(shù)過(guò)程中的皮片,方法似外科取斷層皮片手術(shù)操作,但面積一般2~4平方厘米.

②內(nèi)臟和實(shí)體瘤的取材內(nèi)臟除消化道外基本是無(wú)菌的,但取材時(shí)要明確和熟悉所需組織的類型和部位,實(shí)體瘤取材時(shí)要取腫瘤細(xì)胞豐富的區(qū)域,要避開破潰 壞死液化部分,以防污染,盡量去除混雜的結(jié)締組織.

血液細(xì)胞的取材

血細(xì)胞 淋巴細(xì)胞的取材,一般多抽取靜脈外周血,或從淋巴組織中(如脾 扁桃體 胸腺 淋巴結(jié)等)分離細(xì)胞,取材時(shí)應(yīng)注意抗凝.骨髓 羊水 胸/腹水細(xì)胞取材嚴(yán)格無(wú)菌,注意抗凝,還要盡快分離培養(yǎng),離心后,用無(wú)鈣 鎂PBS洗兩次,再用培養(yǎng)液洗一次后即可培養(yǎng),不宜低溫存放.

動(dòng)物組織取材

Ⅰ鼠胚組織取材

首先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動(dòng)物,然后將其整個(gè)浸泡在含有75%酒精的燒杯中,5分鐘后(注意時(shí)間不能太長(zhǎng),以避免酒精從口或其他通道進(jìn)入體內(nèi),影響組織活力),取出動(dòng)物,

在消毒過(guò)的木板上可用無(wú)菌的圖釘或大頭針固定四肢,切開皮膚,用無(wú)菌操作法解剖取胚或用無(wú)菌止血鉗挾起皮膚 用無(wú)菌眼科剪沿軀干中部環(huán)形剪開皮膚,用止血鉗分別挾住兩側(cè)皮膚拉向頭尾,把動(dòng)物反包,暴露軀干,然后再固定,更換無(wú)菌解剖器材,采用無(wú)菌操作法解剖取出胚胎.

幼鼠胚腎(或肺)取材幼鼠采用上述方法處死消毒后,腹部朝上固定在木板上,先切開游離毛皮并拉開至兩側(cè):然后采用無(wú)菌法打開胸腔取肺,或背部朝上固定在木板上,先將背部毛皮切開游離并拉向兩側(cè),然后采用無(wú)菌法從背部打開腹腔取腎.

雞(鴨)鳥類胚胎組織取材步驟

1 取孵化至適當(dāng)胚齡(9~12天)的胚蛋,用照蛋燈在暗處燈檢,若有豐富血管 胚體有運(yùn)動(dòng)的胚

蛋,說(shuō)明胚體發(fā)育良好,并用有色筆劃出氣室和胚體位置.

2 將胚蛋置于蛋架上,先用溫水清洗蛋殼,再用75%酒精棉球擦干;

經(jīng)碘酒 75%酒精消毒后,在無(wú)菌條件下采用無(wú)菌法用剪刀或鑷子打開氣室,沿氣室邊絳去除蛋

殼;

3 用眼科鑷撕去殼膜,暴露出雞胚;

4 用彎頭鑷輕挑起胚頭,取出胚胎,放入無(wú)菌平皿中,解剖取材.

二 原代細(xì)胞的分離

人或動(dòng)物體內(nèi)(或胚胎組織)由于多種細(xì)胞結(jié)合緊密,不利于各個(gè)細(xì)胞在體外培養(yǎng)中生長(zhǎng)繁殖,必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開,使細(xì)胞解離出來(lái).

1 懸浮細(xì)胞的分離方法

組織材料若來(lái)自血液 羊水 胸水或腹水的懸液材料,最簡(jiǎn)單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘.經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層,這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞.

2 實(shí)體組織材料的分離方法對(duì)于實(shí)體組織材料,由于細(xì)胞間結(jié)合緊密,為了使組織中的細(xì)胞充分分散,形成細(xì)胞懸液,可采用機(jī)械分散法(物理裂解)和消化分離法.

機(jī)械分散法

特點(diǎn):簡(jiǎn)便 快速,但對(duì)組織機(jī)械損傷大,而且細(xì)胞分散效果差,適用于處理纖維成分少的軟組織.

消化分離法

組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊(或湖狀),應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng),使團(tuán)塊膨松,由塊狀變成絮狀,此時(shí)再采用機(jī)械法,用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩,使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散,制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸夜,接種培養(yǎng)后,細(xì)胞容易貼壁生長(zhǎng).

Ⅰ酶消化分離法

酶消化分離法常采用胰蛋白酶(Corning 25-053-CI)和膠原酶(Sigma/Life)

胰蛋白酶是一種胰臟制品,對(duì)蛋白質(zhì)有水介作用,主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵,使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細(xì)胞分散開.膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來(lái)的酶,對(duì)膠原有很強(qiáng)的消化作用.適于消化纖維性組織 上皮組織以及癌組織,它對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用.

除上述兩種最常用的消化酶外,還有鏈霉蛋白酶 粘蛋白酶 蝸牛酶 彈性蛋白酶 木瓜蛋白酶

Ⅱ非酶消化法(EDTA消化法)

EDTA是一種非酶消化物,又稱螯合劑或Versene,全名為乙烯二胺四乙酸.常用不含鈣 鎂離子的PBS配成0.02%的工作液,對(duì)一些組織,尤其是上皮組織分散效果好,該化學(xué)物質(zhì)能與細(xì)胞上的鈣 鎂離子結(jié)合形成螯合物,利用結(jié)合后的機(jī)械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫

離.

Ⅲ消化分離法的操作步驟

剪切.加液漂洗.消化.棄去消化液.漂洗.機(jī)械分散

IⅣ消化分離法的注意事項(xiàng)

組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣 鎂離子和血清對(duì)胰蛋白酶和EDTA的抑制作用.

胰蛋白濃度不宣過(guò)高,作用時(shí)間不能太長(zhǎng),以避免毒性作用.

消化后組織不僅要盡量棄去消化液,以避免毒性產(chǎn)生,而且動(dòng)作要輕,避免膨松的細(xì)胞隨漂洗而

丟失.