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發(fā)布時(shí)間：2020/10/21 17:18:41 閱讀次數(shù)：1469
動(dòng)物組織/細(xì)胞總蛋白提取試劑盒（柱式法）
規(guī)格：50T
保存：RT,1 年
應(yīng)用：可用于動(dòng)物細(xì)胞和組織的總蛋白樣品制備,適用于 SDS-PAGE,WB 等下游應(yīng)用
| 組份 | 規(guī)格 |
| 變性細(xì)胞裂解液 | 25mL |
| 離心管柱 | 50 個(gè) |
| 收集管 | 50 個(gè) |
| 塑料研磨棒 | 2 根 |
產(chǎn)品說(shuō)明：
動(dòng)物細(xì)胞/組織總蛋白提取試劑盒,是新一代超快速蛋白質(zhì)提取工具.越來(lái)越多的證據(jù)表明最常用的 RIPA 緩沖液可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的隨機(jī)損失,產(chǎn)生很多難以解釋的疑難數(shù)據(jù).本試劑盒使用離心管柱提取技術(shù)結(jié)合優(yōu)化的裂解緩沖液可以更快速 更有效地提取總蛋白,使 WB 結(jié)果更加準(zhǔn)確.使用離心管柱提取蛋白,提取體系最低可以低至 20μL,有效的解決了小樣本量的樣本.
知識(shí)點(diǎn)：
1. 蛋白酶抑制劑不是必須加入,但是如果下游實(shí)驗(yàn)需要較長(zhǎng)時(shí)間或者蛋白提取后保存較長(zhǎng)時(shí)間, 建議添加蛋白酶抑制劑.推薦使用 BCA 試劑盒用于蛋白濃度測(cè)定.研究蛋白磷酸化,磷酸酶抑制劑應(yīng)在使用前加入裂解緩沖液.
2. 做 WB 上樣前,仍需和 loading buffer 混勻煮制樣品.
細(xì)胞樣品總蛋白提取
A. 非貼壁細(xì)胞
1. 將離心管柱及接收管套管放在冰上預(yù)冷.
2. 低速離心收集細(xì)胞,在 1.5ml 離心管中加入預(yù)冷的 PBS,旋窩震蕩,500g 離心 2-3 分鐘清洗細(xì)胞.吸去上清,剩余與細(xì)胞體積相同體積的 PBS.渦旋震蕩重懸細(xì)胞.
3. 加入表格 1 中相應(yīng)體積的細(xì)胞裂解液,渦旋震蕩裂解細(xì)胞.（細(xì)胞數(shù)量和裂解液須保證對(duì)應(yīng)關(guān)系,以達(dá)到最佳提取效率）請(qǐng)注意：部分未完全裂解的細(xì)胞不會(huì)影響樣品質(zhì)量.
4. 將裂解的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管柱套管中,14000-16000g 離心 30 秒取出.
5. 立刻將收集管放置于冰上,棄去離心管柱,蛋白提取完成可應(yīng)用于下游實(shí)驗(yàn).
表 1. 不同細(xì)胞體積應(yīng)加入相應(yīng)體積裂解液
| 細(xì)胞體積（μL） | 裂解液（μL） | 相當(dāng)細(xì)胞量 X 106 |
| 3 | 20 | 0.3 |
| 5 | 50 | 0.5 |
| 10 | 100 | 1 |
| 20 | 200 | 2 |
| 40 | 500 | 3 |
1. 將離心管柱及接收管套管放在冰上預(yù)冷
2. 將預(yù)冷的 PBS 直接加入培養(yǎng)板,培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中清洗貼壁細(xì)胞,吸去上清.
3. 按照表 2 中將相應(yīng)體積的細(xì)胞裂解液均勻的加入整個(gè)器皿表面,用移液器吹打幾次,將裂解的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的離心管柱套管中,14000-16000g 離心 30 秒取出.（如提取濃度不佳,可減少裂解液使用量）
4. 
立刻將收集管放置于冰上,棄去離心管柱,蛋白提取完成可應(yīng)用于下游實(shí)驗(yàn).表格 2. 不同貼壁細(xì)胞量應(yīng)加入相應(yīng)體積裂解液
以下步驟是從 15-20mg 組織中提取.如果起始量較大或者較小,需調(diào)整相應(yīng)裂解液的用量比例.
1. 將離心管柱及接收管套管放在冰上預(yù)冷
2. 將 15-20mg 組織放置于離心管柱上,用塑料棍扭轉(zhuǎn)研磨 50-60 次,加入 200μL 細(xì)胞裂解液, 繼續(xù)研磨 30-60 次.（組織用量不要過(guò)量,無(wú)需過(guò)度研磨,裂解液可分兩次加入以得到最佳效果）
注意：塑料研磨棒可以重復(fù)使用,用蒸餾水徹底沖洗干凈,用紙巾擦干.
3. 蓋上蓋子室溫孵育 1-2 分鐘,14000-16000g 離心 1-2 分鐘取出.收集管里的上清是抽提的變性總蛋白.
請(qǐng)注意：部分未完全裂解的組織不會(huì)影響樣品質(zhì)量.
| 問(wèn)題 | 解決方案 |
| 裂解物太粘稠,無(wú)法用 200-1000µL 吸頭吹打 | 將細(xì)胞裂解物倒入離心管柱中或?qū)⑽^剪掉尖端 |
| 離心 30 秒后離心管中還存留細(xì)胞裂解液 | 減少起始細(xì)胞/組織的數(shù)量或增加細(xì)胞裂解液 |
| 低蛋白濃度 | 增加起始細(xì)胞/組織的數(shù)量或減少細(xì)胞裂解液量 |
| 高分子量范圍（100-300KDa）蛋白條帶弱 | 增加細(xì)胞裂解液確保細(xì)胞/組織裂解充分 |
動(dòng)物組織/細(xì)胞總蛋白提取試劑盒
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