細(xì)胞怎么培養(yǎng)才養(yǎng)的更好？

一 不同的細(xì)胞,喜歡的環(huán)境是不一樣的.
這個(gè)不僅僅是說培養(yǎng)基的不同,還有細(xì)胞生長(zhǎng)的空間密度問題.
有一些細(xì)胞是數(shù)量多一點(diǎn)比較好生長(zhǎng),生長(zhǎng)狀態(tài)也比較好.這種一般是屬于生長(zhǎng)速度慢的細(xì)胞.譬如內(nèi)皮細(xì)胞.而有一些是細(xì)胞數(shù)量少一點(diǎn)細(xì)胞狀態(tài)會(huì)生長(zhǎng)的比較好,譬如巨噬細(xì)胞和某些腫瘤細(xì)胞.尤其是巨噬細(xì)胞,生長(zhǎng)速度非常的快,貼壁速度很快,所以傳代時(shí)就應(yīng)該留很少量的細(xì)胞,這樣細(xì)胞狀態(tài)會(huì)比較好.并且巨噬細(xì)胞比較喜歡扎堆生長(zhǎng),而堆與堆之間是有空間的.如果長(zhǎng)成相連在一起的一滿片的時(shí)候,細(xì)胞形態(tài)基本上就會(huì)差了,老化的會(huì)比較多,對(duì)后期實(shí)驗(yàn)結(jié)果是不好的.所以在養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)候應(yīng)該摸索該細(xì)胞喜歡的生長(zhǎng)空間密度問題.
二 對(duì)于有些人總是會(huì)遇到養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)怎么都不好的問題.
這個(gè)其實(shí)是有一個(gè)方法可以改善的.對(duì)于貼壁細(xì)胞,如果細(xì)胞形態(tài)不好,（或者細(xì)胞形態(tài)不清晰,表面似有異物等）可以在傳代的時(shí)候進(jìn)行如下操作：
首先,倒掉舊的培養(yǎng)基,加入 3 ml 新的培養(yǎng)基（有無血清的都可）洗滌一次,用滴管吸走,然后再加入 3 ml 的培養(yǎng)基,進(jìn)行預(yù)吹打,控制吹打力度,輕輕地大概沿著瓶底過一遍,然后吸走.這時(shí)候再開始正式的消化 吹打.（巨噬細(xì)胞我們只吹打,不消化的）
其次,把吹打下來的細(xì)胞懸液加入到新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),培養(yǎng)瓶事先加入培養(yǎng)基,放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),按時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞貼壁情況.10 分鐘觀察一次,20 分鐘,30 分鐘觀察一次.選擇一個(gè)時(shí)間點(diǎn),已經(jīng)有部分細(xì)胞貼壁的情況下,重新置于潔凈臺(tái),底面朝上迅速倒出其中的培養(yǎng)基,加入 3 ml 新培養(yǎng)基再輕輕洗一次.然后加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng).后續(xù)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況以及形態(tài).
如果一次效果還不理想,可重復(fù)多次.直到找到細(xì)胞完美形態(tài).其中要注意,結(jié)合細(xì)胞喜歡的生長(zhǎng)情況.喜歡多一點(diǎn)數(shù)量長(zhǎng)得好的細(xì)胞你就等貼壁細(xì)胞比較多點(diǎn)的時(shí)候再傳.反之亦然.
三 關(guān)于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入培養(yǎng)基的量的問題.
這個(gè)是要靠自己去摸索你所養(yǎng)的細(xì)胞的.并不是小的玻璃方瓶 12 ml,大方瓶 14 ml 的.有些細(xì)胞反而是培養(yǎng)基少一點(diǎn)相反細(xì)胞形態(tài)會(huì)長(zhǎng)得比較好.對(duì)于生長(zhǎng)速度快的細(xì)胞,易生長(zhǎng)的細(xì)胞加少一點(diǎn)培養(yǎng)基細(xì)胞形態(tài)會(huì)更好.但是要注意換液掌握.
四 關(guān)于選擇培養(yǎng)瓶的問題.
生長(zhǎng)速度快的細(xì)胞在玻璃瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)的狀態(tài)會(huì)比一次性塑料瓶相對(duì)好一些.而對(duì)于同一種細(xì)胞,在其生長(zhǎng)旺盛快速的時(shí)期在玻璃瓶?jī)?nèi)的生長(zhǎng)狀態(tài)也比塑料瓶?jī)?nèi)好.這可能是因?yàn)樗芰掀勘炔Ａ�瓶更容易貼壁.生長(zhǎng)速度快的細(xì)胞在塑料瓶這種相對(duì)「更安逸」的環(huán)境里反而長(zhǎng)的狀態(tài)不如玻璃瓶好.所以對(duì)于生長(zhǎng)速度慢的細(xì)胞如果想要更漂亮的細(xì)胞狀態(tài),塑料瓶比玻璃瓶會(huì)好,對(duì)于生長(zhǎng)速度慢的細(xì)胞,玻璃瓶則會(huì)更好.同樣,對(duì)于同一種細(xì)胞,在其生長(zhǎng)速度慢的時(shí)候,塑料瓶會(huì)好一點(diǎn),比如剛剛復(fù)蘇的時(shí)候,或者原代培養(yǎng)的時(shí)候.而在其生長(zhǎng)旺盛的時(shí)候,玻璃瓶則相對(duì)會(huì)好一點(diǎn).
五 傳代時(shí)消化的問題.
對(duì)于需要消化傳代的細(xì)胞,每一次的消化都是對(duì)這個(gè)細(xì)胞存活與否,狀態(tài)好與不好最至關(guān)重要的考驗(yàn).
很多人都遇到過這個(gè)問題,自己養(yǎng)的細(xì)胞開始的幾代長(zhǎng)得還挺好的,可是傳過幾代之后就發(fā)現(xiàn)自己的細(xì)胞不行了,狀態(tài)越來越差勁了.對(duì)于這個(gè)問題,可以非常肯定地說,你的消化環(huán)節(jié)出問題了.你每一次的消化都讓細(xì)胞受到較大損傷了.所以,越長(zhǎng)越差.
在消化過程中,加入胰酶后,所有細(xì)胞都在被胰酶消化著,但是我們忽視了一個(gè)問題就是,細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)是不一樣的,有的貼壁牢固,有的貼壁沒有那么牢固的,所以,讓所有的細(xì)胞消化同樣的時(shí)間對(duì)細(xì)胞是不公平的,應(yīng)該對(duì)消化的方法進(jìn)行改良,爭(zhēng)取做到因材施教.
具體操作：

當(dāng)然了,如果細(xì)胞是屬于那種很容易消化的細(xì)胞,像 RAW264.7,僅僅第二步就搞定了.就沒必要第三步第四步了.
將細(xì)胞消化分成這幾步,除了是為了避免胰酶對(duì)細(xì)胞的損傷之外,還有一個(gè)更重要的作用就是,可以盡量地把細(xì)胞吹打成單個(gè)單個(gè)的狀態(tài),不成片不連體.
因?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)的時(shí)候肯定是要相互聯(lián)系,大部分的細(xì)胞都是要成片生長(zhǎng)的,尤其是對(duì)于貼壁細(xì)胞,單個(gè)細(xì)胞貼壁之后長(zhǎng)著長(zhǎng)著就長(zhǎng)到一片去了.但是如果是成片的細(xì)胞抱團(tuán)的話,傳代后細(xì)胞是不能貼壁的,這樣抱團(tuán)的細(xì)胞就會(huì)死亡.所以,消化傳代的時(shí)候一定要將細(xì)胞消化成單個(gè)單個(gè)的獨(dú)立狀態(tài).
細(xì)胞一旦脫落入懸液里你很難再將它吹打成單個(gè),因?yàn)樗鼪]有受力點(diǎn)了.很難找到受力點(diǎn)讓你對(duì)它吹打的力分散開細(xì)胞.所以必須要在細(xì)胞未脫落之前將其吹打開,受力點(diǎn)就是細(xì)胞貼壁的地方.這樣你就必須要嚴(yán)格控制好消化的程度.既要消化到容易吹打下來,又不能太過,一吹就整片脫落,要單個(gè)單個(gè)地往下掉.所以我才要分批分次地加胰酶消化就是為了保證不同生長(zhǎng)狀態(tài)貼壁程度的細(xì)胞能夠都維持在好的受力點(diǎn)分散開.這個(gè)是很重要的一點(diǎn),尤其是對(duì)于某些細(xì)胞這一點(diǎn)就是它活去死的致命點(diǎn),像 Caco-2 細(xì)胞就是如此.
另外關(guān)于傳代很重要一點(diǎn)就是一定不能等到細(xì)胞長(zhǎng)滿的時(shí)候才去消化傳代.要在細(xì)胞長(zhǎng)到70%左右的時(shí)候就要傳代了,一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)中已經(jīng)有疊層生長(zhǎng)的時(shí)候就要立即進(jìn)行消化傳代,不能再拖了.
六 關(guān)于換液傳代時(shí)候洗瓶的問題.
對(duì)于用 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞,你在洗的時(shí)候如果是用無血清1640去洗細(xì)胞在隨即后的幾次中會(huì)比用 DMEM 洗的長(zhǎng)的要好.同樣,用 1640 培養(yǎng)的也有這個(gè)現(xiàn)象.
如果不嫌麻煩,可以用 PBS 來洗,洗的效果和用無血清培養(yǎng)基洗的效果基本上是一樣的,對(duì)于有些細(xì)胞會(huì)更勝一籌.洗的目的主要是洗去培養(yǎng)瓶里殘留的血清,防止它對(duì)胰酶的影響.這樣能夠保證胰酶的消化能力優(yōu)先,是很關(guān)鍵的一點(diǎn).
傳代時(shí) PBS 洗是很重要的一步,最近發(fā)現(xiàn),用 PBS 就可以把細(xì)胞消化開來.加入 PBS 放置 10-15 分鐘,有些需要更長(zhǎng)的時(shí)間,等到細(xì)胞一個(gè)個(gè)分離開來的時(shí)候,就可以直接吹打下來,但是和胰酶消化一樣,要控制好時(shí)間,不能時(shí)間太過了,要不然損傷細(xì)胞,細(xì)胞不容易成活,狀態(tài)容易不好.這個(gè)方法對(duì)于某些細(xì)胞是很管用的.有些細(xì)胞用胰酶消化不容易消化成單個(gè)的時(shí)候,或者臨時(shí)沒有胰酶了,可以選用此方法.不過一定要試試,看是否適合你的細(xì)胞.

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