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發(fā)布時間：2024/8/19 9:05:31 閱讀次數(shù)：290
無論新人還是老手,在細胞培養(yǎng)過程中都可能遇到細胞污染的情況.那對于細胞污染,最重要的是預防,因為細胞一旦污染,想救是非常困難的,即便救活,細胞狀態(tài)也會變差,進而影響實驗結(jié)果,所以先來講講如何預防
無論新人還是老手,在細胞培養(yǎng)過程中都可能遇到細胞污染的情況.那對于人源細胞或鼠源細胞的污染,最重要的是預防,因為細胞一旦污染,想救是非常困難的,即便救活,細胞狀態(tài)也會變差,進而影響實驗結(jié)果,所以先來講講如何預防.生物安全柜是細胞處理的主要場所,而培養(yǎng)箱是細胞生長的主要場所,所以細胞污染通常就發(fā)生在這兩個地方.那么在使用生物安全柜和培養(yǎng)箱時如何做好預防措施呢？
首先,所有進入安全柜的東西都要盡可能保證無菌.如果實驗室條件允許,那直接購買商品化的試劑和耗材是最穩(wěn)妥的,例如Gibco Hyclone的試劑,Eppendorf Corning的耗材,這些大品牌的試劑和耗材一般只要是正品都可以保證無菌.如果試劑需要自己用干粉配制,那么在配制中需要嚴格按無菌操作進行.另外每次試劑配制量不宜過多,比如完全培養(yǎng)基建議以一到兩周內(nèi)用完為宜.試劑在分裝時可以考慮再用針頭式過濾器過濾一次,減少污染的可能性.如果所用移液器吸頭是散裝的,則注意在將吸頭裝入吸頭盒時需要帶手套,因為滅菌時無法完全去除吸頭上可能粘附的油脂和其他雜質(zhì).
其次,安全柜每次使用前需要紫外照射30min滅菌,然后通風5min以上保證換氣到位.每次處理細胞前應將實驗需要的各種試劑 耗材備齊,盡量減少細胞處理過程中的來回走動.安全柜內(nèi)的東西盡量擺放有序,具體可以根據(jù)個人使用習慣而定,如果你使用的是公用安全柜,則可能需要使用前臨時調(diào)整.以個人為例,移液器和吸頭盒放右手邊,實驗中常用試劑放右前方,廢液缸放左前方,并保證和試劑有一定安全距離,右角放置培養(yǎng)皿,左角放置其他耗材.大致原則是盡量保證最常用的東西靠右,次常用的東西靠左,右邊操作區(qū)域為潔凈區(qū),左邊操作區(qū)域為非潔凈區(qū),左撇則相反.
然后,實驗過程中所有試劑不用時需要蓋上瓶蓋,瓶蓋打開時除了干凈的吸頭,其他任何東西都不要從瓶口的上方經(jīng)過.如果使用培養(yǎng)皿培養(yǎng)細胞,則處理時不要長時間打開皿蓋.如果所用吸頭沒有濾芯,那在使用時注意不要將試劑倒吸入移液器,如果倒吸的是培養(yǎng)基,極易成為細菌生長的溫床.一把有菌的移液器可以輕松污染所有使用其處理過的細胞,所以一旦發(fā)生倒吸,要及時用酒精棉球擦去倒吸的試劑,有條件的建議使用帶濾芯的吸頭.由于使用安全柜的過程中手和前臂都要進入安全柜,所以有條件的可以準備一件細胞房專用無塵服,使用前裝入布袋消毒后烘干,在細胞房中取出,非更換前不要穿出細胞房.沒有條件的則可以準備一副袖套,每次用完后放安全柜中紫外消毒.無論是否穿戴無塵服或者袖套,實驗過程中只要手出了安全柜,再進入前都需要用75%的酒精消毒.
最后,如果使用培養(yǎng)皿培養(yǎng)細胞,放入培養(yǎng)箱前搖勻時要輕柔,不要將培養(yǎng)基搖到皿蓋和皿身的間隙中,這樣在細胞生長時很容易污染.如果使用瓶蓋沒有氣孔的細胞瓶培養(yǎng)細胞,放入培養(yǎng)箱前需要將瓶蓋擰松半圈左右,保證瓶內(nèi)外可以進行氣體交換,注意不要擰太松,這樣在細胞生長時也很容易污染,有條件的建議選擇瓶蓋有氣孔的細胞瓶,這樣放入培養(yǎng)箱前直接擰緊瓶蓋即可.由于培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度和濕度很高,所以最好定期用75%酒精擦拭培養(yǎng)箱消毒.培養(yǎng)箱里水槽中的水需要使用無菌水,不可以用自來水.
那么細胞如果還是不幸污染了又該怎么辦呢？把細胞污染分為早期污染和晚期污染兩種情況.早期污染是細胞狀態(tài)變差,但依舊能保持生長,顯微鏡下未見明顯微生物或可見少量微生物.這種情況的話我們在換液時可以多用PBS洗幾次,然后加入適合的抗生素.早期污染只要發(fā)現(xiàn)及時,處理得當,救回來的可能性還是很大的.晚期污染則是細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,細胞停止生長,顯微鏡下可見大量微生物.這時候建議大家及時清理掉相關(guān)細胞,以免污染其他細胞.在對安全柜和培養(yǎng)箱進行消毒后,再重新復蘇早批次的細胞.細心的會發(fā)現(xiàn),新細胞收到后,不應急于開展實驗,而應該先小心培養(yǎng),凍存一到兩個批次的細胞后再開展實驗,這樣實驗過程中如果細胞出現(xiàn)問題,可以有凍存細胞保證實驗還能繼續(xù)進行.
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