一站式柱式 miRNAout 是在miRNAout (CAT#:70501)基礎(chǔ)上自主開發(fā)的柱式
升級產(chǎn)品，是目前國內(nèi)外市場上最快速最簡單的小 RNA 分離純化產(chǎn)品。
它具有下列特點(diǎn)：
1. 一步法直接分離純化小 RNA，比兩步法（先分離總 RNA 和再純化其中的小 RNA）和 PAGE 電泳回收法更簡單。得到的小 RNA 長度大部分在 200 nt 以下，包括 5S RNA、tRNA、miRNA、Pre-miRNA、
pri-miRNA、siRNA、shRNA 和 snRNA 等。
2. 柱式操作，比 miRNAout 更加簡單快捷，整個(gè)過程只需要十多分鐘。
3. 適用范圍廣，可以用于動(dòng)物組織、血液及部分植物組織等實(shí)驗(yàn)材料。
4. 小 RNA 純凈，OD260/280 一般都在 1.9 以上。
5. 產(chǎn)率一般為 20-40 ug/100 mg 動(dòng)物組織。
6. 無基因組 DNA 的污染。
7. 可用于 RT-PCR、miRNA 標(biāo)記、microarray 等后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
由于離心吸附柱的吸附量限制，本產(chǎn)品每次提取只能處理 100mg 左右的各種組織，可以在 1.5 mL 塑料離心管中。如果處理樣品量大，請分成很多相當(dāng)于微量提取的量進(jìn)行，最后再收集在一起。
1. 新鮮配制裂解液。將溶液 A 和溶液 B 按 1:1 的比例混合，然后根據(jù)組織細(xì)胞類型的不同分為下面及種情況使用。注意：溶液 A 和溶液 B 混合后必須立即使用，不要放置，否則會產(chǎn)生沉淀。
a)對貼壁細(xì)胞：吸盡培養(yǎng)液，在每 10 平方厘米細(xì)胞中加入 1mL 新鮮配制的裂解液，用槍輕柔吹打數(shù)次，確保細(xì)胞全部裂解。b)對懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，吸盡液體，在每 1-5×106 懸浮細(xì)胞中加入
1mL 新鮮配制的裂解液，用槍輕柔吹打數(shù)次，確保細(xì)胞全部裂解。如果是fibroblasts 或 carcinomacell，1mL 新鮮配制的裂解液的細(xì)胞使用量不要超過 1×106 個(gè)細(xì)胞。c)對新鮮的動(dòng)物或植物實(shí)體組織：勻漿法：先將剪切成小塊新鮮組織或液氮保存的組織放入 10mL 或 15mL 塑料離心管中，每 50-100mg 組織加 1mL
新鮮配制的裂解液，用剪切式勻漿機(jī)勻漿 30 秒左右。對肝、脾、胰、腎等細(xì)胞分裂十分旺盛的組織（細(xì)胞中含大量正在復(fù)制的 DNA），建議組織的使用
量不要超過 50mg/mL 裂解液，否則十分容易產(chǎn)生 DNA 污染。液氮研磨法：將組織在液氮中研磨成粉，然后轉(zhuǎn)移到新配制的裂解液中，震蕩混勻。d)對在 RNALOCKER 等非凍型保存液中保存的動(dòng)物或植物實(shí)體組織組織：先用紙吸去 RNALOCKER 液體后再剪切成小塊，再按新鮮實(shí)體組織的處理
方法處理。
2. 將裂解物轉(zhuǎn)移至一個(gè)干凈的 1.5mL 塑料離心管中，然后加入 0.2 倍體積的自備氯仿(1mL 裂解物需 0.2ml 氯仿)，振蕩器上充分振蕩混均 30 秒。
3. 12000-15000g 室溫離心 3-5 分鐘。
4. 將上清液（約 0.6-0.8mL）轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。注意：離心后下層有機(jī)相和中間層含有 DNA 和蛋白質(zhì)，避免觸及，否則將產(chǎn)生蛋白質(zhì)和 DNA 污染。
為保險(xiǎn)起見，可以留下 100uL 上清液不取。同時(shí)吸取上清時(shí)最好緩慢進(jìn)行，否則容易吸出交界面的不可見的絲狀 DNA。
5. 12000-15000g 室溫離心半分鐘，收集管中的穿透液。大 RNA 及 DNA 將與離心吸附柱的膜結(jié)合，小 RNA 將存在于穿透液中。但由于離心吸附柱的最大吸附能力為 40ug 動(dòng)物 RNA，20ug 植物 RNA，所以如果樣品中的大 RNA含量高于上面數(shù)值，則需要減少上樣量，否則穿透液中將同時(shí)含有大 RNA 和小 RNA。如果不減少上樣量，也可以將穿透液再次重復(fù)上柱以去除大 RNA。
由于此時(shí)離心吸附柱已經(jīng)吸附了大 RNA，所以需要提前對離心吸附柱進(jìn)行預(yù)處理（具體步驟見本手冊最后的附錄）。
6. 在最后得到的不含大 RNA 的穿透液中加等體積的溶液 C，混勻。此時(shí)溶液的總體積約 1.5mL。
7. 先轉(zhuǎn)移約 0.75mL 到離心吸附柱中，12000-15000g 室溫離心半分鐘，棄收集管中的穿透液。
8. 將上步上柱剩余的樣品轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，12000-15000g 室溫離心半分鐘，棄收集管中的穿透液。
9. 加 0.7mLmiRNA 專用洗柱液到離心吸附柱中，12000-15000g 室溫離心半分鐘，棄穿透液。
10.加 0.3mLmiRNA 專用洗柱液到離心吸附柱中，12000-15000g 室溫離心半分鐘，棄穿透液。此步一般可以省略。
11. 12000-15000g 室溫離心半分鐘以甩出殘聯(lián)液體。此步十分重要，否則殘留的 miRNA 專用洗柱液會影響 miRNA 的使用。
12.將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到一自備的 RNase-free 收集管中，加入 30-50uLRNA 洗脫液，室溫放置 3-5 分鐘。
13. 12000-15000g 室溫離心半分鐘，離心管中溶液即為 miRNA 樣品，可以立
即使用或存放于-80℃待用。
附錄：離心吸附柱反復(fù)上樣去除大 RNA 的流程
1. 將結(jié)合有大 RNA 和 DNA 的寬口離心吸附柱中加入 0.1mL 自備的超純水，12000-15000g 室溫離心半分鐘，棄收集液。
2. 再加 0.1mL 自備的超純水，重復(fù)上步一次。
3. 將第 5 步的得到、需要進(jìn)一步去除其中大 RNA 和 DNA 污染的穿透液直接上柱，12000-15000g 室溫離心半分鐘，收集穿透液（此穿透液含小 RNA）。
4. 如果大 RNA 已經(jīng)去干凈，可以直接進(jìn)入第 6 步。一般樣品只需要額外處理一次就可以去除全部的大 RNA 污染。
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