離心柱式RNAeasy™動(dòng)物RNA抽提試劑盒(RNAeasy™ Animal RNA Isolation Kit with Spin Column)是一種基于離心柱法從動(dòng)物組織或培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞中安全、快速、便捷、穩(wěn)定、高效、高質(zhì)量地抽提長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸(nucleotide, nt)的RNA的試劑盒。抽提獲得的大于200個(gè)核苷酸的RNA(也常被稱(chēng)為總RNA)可以用于各種常規(guī)用途。

本試劑盒抽提得到的RNA可用于反轉(zhuǎn)錄、RT-PCR、qPCR、Northern、點(diǎn)雜交(Dot Blot)、純化mRNA、體外翻譯、RNase protection assay、cDNA克隆等下游實(shí)驗(yàn)；也可用于基因表達(dá)芯片分析(microarray)、高通量測(cè)序(high throughput
sequencing)等對(duì)RNA質(zhì)量要求較高的情況。
三款離心柱式及Trizol法RNA抽提試劑盒的主要特點(diǎn)和差異如下：

動(dòng)物組織或細(xì)胞中的RNA按照長(zhǎng)度可以分為長(zhǎng)鏈RNA(long RNA)和小RNA(small RNA)，長(zhǎng)鏈RNA通常大于200nt，而小RNA通常小于200nt。長(zhǎng)鏈RNA按照是否編碼蛋白或多肽可以分為長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)和mRNA。小RNA主要包括非編碼的5.8S rRNA(ribosomal RNA)、5S rRNA、tRNA(transfer RNA)、microRNA(miRNA)、siRNA(small interfering RNA)、piRNA(Piwi-associated small RNA)、tsRNA(tRNA-derived small RNA)、srRNA(small rDNA-derived RNA)等。
本試劑盒抽提RNA的基本流程如圖1所示。樣品在裂解液中迅速裂解，釋放出總RNA，然后讓RNA特異性地結(jié)合到純化柱上，而基因組DNA和蛋白質(zhì)等其它組分通過(guò)高速離心被有效去除，再通過(guò)3次洗滌充分去除非特異性結(jié)合的蛋白、鹽等雜質(zhì)，最后用洗脫液將高純度的RNA洗脫下來(lái)。

圖1. 離心柱式RNA抽提流程示意圖

本試劑盒使用安全。本試劑盒通過(guò)特殊的柱純化介質(zhì)進(jìn)行RNA分離純化，能有效避免傳統(tǒng)的Trizol法抽提時(shí)使用的酚、氯仿等有毒有害有機(jī)試劑。
本試劑盒使用快速、便捷。本試劑盒采用柱純化，無(wú)需繁瑣的RNA沉淀步驟，抽提操作過(guò)程僅15-20分鐘。相比于傳統(tǒng)的Trizol抽提法，本試劑盒的操作流程顯著簡(jiǎn)化，縮短了抽提時(shí)間，降低了RNA被降解的風(fēng)險(xiǎn)。和國(guó)外同類(lèi)柱純化產(chǎn)品相比，所需操作步驟和操作時(shí)間基本一致。
本試劑盒抽提RNA的得率高，優(yōu)于國(guó)外同類(lèi)產(chǎn)品。本試劑盒的抽提效果經(jīng)反復(fù)測(cè)試，100萬(wàn)個(gè)HeLa細(xì)胞能抽提得到約15-20μgRNA，20mg小鼠肝組織能抽提得到約25-35μgRNA，20mg小鼠腦組織中抽提得到約10-20μgRNA(新鮮樣品的得率高于凍存樣品)。本試劑盒與傳統(tǒng)的Trizol方法及國(guó)際知名Q品牌同類(lèi)產(chǎn)品的抽提效果對(duì)比參見(jiàn)圖2。
本試劑盒抽提得到的RNA純度高，顯著優(yōu)于Trizol和國(guó)外Q品牌的同類(lèi)產(chǎn)品。本試劑盒抽提得到的RNA的A260/A280通常為2.0-2.2。A260/A230通常為1.9-2.1。本試劑盒與傳統(tǒng)的Trizol方法及國(guó)際知名Q品牌同類(lèi)產(chǎn)品的抽提效果對(duì)比參見(jiàn)圖2。由圖2可知，本試劑盒在抽提組織樣品的RNA時(shí)，A260/A230非常顯著地高于Trizol法和Q品牌的同類(lèi)產(chǎn)品，提示純度高。

圖2. 本試劑盒與Trizol、Q品牌同類(lèi)產(chǎn)品的RNA抽提效果對(duì)比。樣品為凍存的50萬(wàn)個(gè)HeLa細(xì)胞、20mg小鼠肝組織和20mg小鼠腦組織。洗脫液用量均為40μl。均取6μl洗脫的樣品經(jīng)變性處理后，在含6.67%甲醛和適量NA-Red的1.2%變性瓊脂糖凝膠中電泳約45分鐘后拍照。實(shí)際抽提效果會(huì)因?qū)嶒?yàn)條件、檢測(cè)儀器等的不同而存在差異，本圖僅供參考。
注：純的RNA其A260/A280約為2.0，但在很多儀器上測(cè)定時(shí)會(huì)高于2.0，低于1.9通常認(rèn)為有蛋白、DNA或者酚等的污染；純的RNA其A260/A230約為2.0左右或者略高，低于1.9通常認(rèn)為有碳水化合物、胍鹽、多肽或酚等的污染。

本產(chǎn)品與Qiagen公司的RNeasy Mini Kit一致，用于純化200nt以上的RNA，對(duì)小于200nt的small RNA即小RNA(如5.8S rRNA、5S rRNA、tRNA、miRNA、piRNA等)被選擇性地去除，如果希望抽提得到小于200nt的小RNA，推薦RNAeasy™動(dòng)物小RNA抽提試劑盒(離心柱式)(R0028)或RNAeasy™ Plus動(dòng)物RNA抽提試劑盒(離心柱式)(R0032)。
本試劑盒適用于新鮮或凍存的動(dòng)物組織或細(xì)胞RNA的抽提，推薦的細(xì)胞用量為50-100萬(wàn)(上限可達(dá)1000萬(wàn))，組織用量為15-20mg(上限可達(dá)30mg)。對(duì)于不同的組織或細(xì)胞上限會(huì)有所差別，例如小鼠肝臟組織的上限可達(dá)30mg，但肌肉組織的上限為20mg。
本試劑盒可用于12個(gè)樣品的RNA抽提。
包裝清單：

保存條件：
室溫保存，一年有效。
注意事項(xiàng)：
對(duì)于富含RNase的樣品(如動(dòng)物組織)，建議使用前在裂解液中添加二硫蘇糖醇(Dithiothreitol, DTT)至終濃度為40mM (例如1ml裂解液中加入20μl 2M DTT)或β-巰基乙醇至終濃度為1% (如1ml裂解液中加入10μl β-巰基乙醇)。含DTT或β-巰基乙醇的裂解液可在室溫放置1個(gè)月。
通過(guò)本試劑盒抽提到的RNA已經(jīng)去除絕大多數(shù)DNA，通常情況無(wú)需DNase處理。后續(xù)如進(jìn)行某些對(duì)極少量DNA殘留較敏感的實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以在使用說(shuō)明中步驟4離心后，在純化柱中加入適量DNase I (如80μl含10U DNase I的酶溶液，推薦使用DNase I，D7076)，室溫消化15分鐘。消化結(jié)束后，不要離心，直接加入500μl洗滌液II，進(jìn)入使用說(shuō)明的步驟5進(jìn)行操作。
本試劑盒提供的所有試劑和耗材都是RNase-free，操作時(shí)應(yīng)小心，避免被污染。所有自行準(zhǔn)備的試劑和耗材也都應(yīng)是RNase-free。如果可能有RNase污染，可考慮用0.01%的DEPC水浸泡過(guò)夜，然后高溫高壓滅菌并烘干。操作時(shí)應(yīng)避免對(duì)著樣品或所使用的試劑盒耗材呼氣或說(shuō)話(huà)，以防RNase污染。建議戴一次性口罩操作。
對(duì)于操作環(huán)境中RNA酶的去除，推薦使用生產(chǎn)的RNase and DNase Away (R0123)以去除實(shí)驗(yàn)桌面上或其它接觸面上的RNase。
使用凍存的細(xì)胞或組織抽提RNA的效果通常比新鮮的細(xì)胞或組織差一些。因?yàn)樵诩?xì)胞或組織凍融過(guò)程中一些細(xì)胞或組織內(nèi)的RNase會(huì)被釋放出來(lái)并剪切樣品中的RNA。對(duì)于組織樣品，推薦使用RNALater™動(dòng)物組織RNA穩(wěn)定保存液(R0118)進(jìn)行保存以保證樣品RNA的完整性。
本試劑盒所有操作均在室溫進(jìn)行，操作時(shí)無(wú)需冰浴。所有離心也均在室溫進(jìn)行。
廢液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丟棄。
結(jié)合液、洗滌液中含有乙醇，使用后須旋緊瓶蓋以防揮發(fā)，并須按照易燃試劑的相關(guān)規(guī)范進(jìn)行存放和使用。
本產(chǎn)品僅限于專(zhuān)業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說(shuō)明：
1. 樣品的準(zhǔn)備。
細(xì)胞樣品：收集50-100萬(wàn)左右的細(xì)胞。對(duì)于懸浮細(xì)胞，1000-2000g離心1分鐘后棄上清，加入300μl裂解液，輕輕吹打8-10次至固懸物溶解、溶液澄清；對(duì)于貼壁細(xì)胞，吸凈培養(yǎng)液后加入300μl裂解液，輕輕吹打5-10次至固懸物溶解、溶液澄清，轉(zhuǎn)移至一潔凈離心管內(nèi)。
組織樣品：取15-20mg動(dòng)物組織，置于液氮中研磨成粉末，立即加入600μl裂解液。也可將組織置于1.5ml離心管中，迅速加入600μl冰浴預(yù)冷的裂解液，用微型電動(dòng)勻漿器勻漿，或者用普通玻璃勻漿器進(jìn)行勻漿。研磨或勻漿后，輕輕吹打勻漿液8-10次，室溫放置3-5分鐘。然后約14,000g離心2分鐘，將上清液移至新的離心管中。對(duì)于比較容易裂解且勻漿很充分的組織(如肝組織、腦組織等)可以不用高速離心而直接進(jìn)入步驟2。
注意：細(xì)胞的數(shù)量一般不超過(guò)500萬(wàn)，不超過(guò)100萬(wàn)細(xì)胞宜使用300μl裂解液，多于100萬(wàn)細(xì)胞宜使用600μl裂解液。動(dòng)物組織的用量一般不超過(guò)30mg，用量過(guò)多可能會(huì)因裂解不充分導(dǎo)致得率下降。組織樣品在裂解和離心后，離心管下部可能會(huì)有一些膠狀物質(zhì)，宜作為上清轉(zhuǎn)移至下一步操作。如果棄除膠狀物，會(huì)導(dǎo)致得率下降約30-50%。后續(xù)加入結(jié)合液后膠狀物會(huì)消失。離心是為了去除未勻漿充分的明顯塊狀物。如果裂解后仍有粘稠物，需增加吹打次數(shù)至溶液完全澄清。對(duì)于富含RNase的樣品，裂解液中宜添加DTT至終濃度為40mM或添加β-巰基乙醇至終濃度為1%。
2. 加入等體積結(jié)合液至裂解液中，輕輕顛倒混勻3-5次。此時(shí)可能會(huì)有沉淀物產(chǎn)生，屬于正�，F(xiàn)象。
3. 將混合物(包括沉淀物)轉(zhuǎn)移至純化柱內(nèi)，12,000g離心30秒，倒棄收集管內(nèi)液體。
注意：當(dāng)裂解液的體積大于300μl時(shí)，在加入等體積結(jié)合液后，總體積會(huì)超過(guò)純化柱的容量，這時(shí)應(yīng)分成2次過(guò)柱，即將一半的混合物過(guò)柱后，再將剩余的混合物重復(fù)步驟3一次。對(duì)于一些特殊的樣品，如出現(xiàn)溶液未完全通過(guò)時(shí)，可延長(zhǎng)離心時(shí)間至1-2分鐘，或者加大離心力至16,000g。對(duì)于一些能快速啟動(dòng)達(dá)到12,000g的離心機(jī)，離心30秒已經(jīng)足夠，對(duì)于一些啟動(dòng)速度緩慢的離心機(jī)本步驟及后續(xù)步驟中的30秒離心宜調(diào)整為60秒。
4. 加入600μl洗滌液I，12,000g離心30秒，倒棄收集管內(nèi)液體。
5. 加入600μl洗滌液II，12,000g離心30秒，倒棄收集管內(nèi)液體。
6. 重復(fù)步驟5一次。
7. 最高速(約14,000-16,000g)離心2分鐘，去除殘留的液體。
8. 將RNA純化柱置于本試劑盒提供的RNA洗脫管中，加入30-50μl洗脫液，室溫放置2-3分鐘，最高速離心30秒，所得溶液即為純化的RNA。
注意：洗脫液需要加到純化柱柱面中央，使其被完全吸收。如需獲得更高濃度的樣品，可把洗脫液的體積減小至20μl，但洗脫下來(lái)的RNA量會(huì)相對(duì)減少。室溫較低時(shí)，洗脫液在37℃預(yù)熱片刻對(duì)得率有所幫助。此外，洗脫后的溶液再次加回到原純化柱再離心洗脫一次，可提高得率約10-30%；或者在第一次洗脫后使用新的洗脫液再洗脫一次，會(huì)獲得約為第一次洗脫量15-40%的RNA。​