y MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)，即 M-MuLV Reverse Transcriptase(RNase H minus)是一種經(jīng)過改造和優(yōu)化的M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)。和普通的M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶相比， M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)也是一種依賴于RNA或DNA模板的DNA聚合酶，可以以RNA或DNA為模板在引物存在的情況下完成互補DNA鏈的合成；但缺失了Ribonuclease H(RNase H)酶活性，不能夠選擇性剪切RNA和DNA雜合雙鏈中的RNA。 M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase
H-)是最常用的反轉(zhuǎn)錄酶之一。
特點：-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)可以合成長達13kb的cDNA，而普通的M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)僅能合成長達9kb的cDNA； M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)的最適反應(yīng)溫度為42-45℃并且在55℃時仍然有很高活性，可以避免普通的M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)在37℃反應(yīng)時的一些不足。
用途：M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)常用于在獲得總RNA或mRNA后cDNA第一條鏈的合成。 M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)合成的cDNA第一條鏈后續(xù)可以用于PCR、real-time PCR、cDNA第二條鏈的合成等。
M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)也可以用于DNA探針的標(biāo)記，通過引物延伸(primer extention)來分析RNA，以及用于基因芯片熒光探針的標(biāo)記。
來源：本 M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)由大腸桿菌表達，表達的基因為經(jīng)過突變優(yōu)化的編碼Moloney Murine
Leukemia Virus reverse transcriptase的pol基因片段。
活性定義：One unit of the enzyme incorporates 1 nmol of dTMP into a polynucleotide fraction in 10 min at 37℃. Enzyme activity is assayed in 50 mM Tris-HCl(pH 8.3), 6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 40 mM KCl, 0.5 mM dTTP, 0.4 MBq/ml [3H]-dTTP, 0.4 mM polyA·oligo(dT)12-18。
純度：不含DNA內(nèi)切酶、外切酶和磷酸酯酶和RNA酶，可以滿足常規(guī)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈等的需要。
酶儲存溶液：50 mM Tris, pH 8.3, 100mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 0.1% Triton X-100 and 50% glycerol。
Reaction Buffer(5X)：250 mM Tris, pH 8.3 at 25℃, 250 mM KCl, 20 mM MgCl2, 50 mM DTT。
失活或抑制：70℃孵育10分鐘可以導(dǎo)致 M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)失活；EDTA、EGTA等螯合劑、無機磷酸鹽或焦磷酸鹽以及聚氨(polyamine)對M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)有抑制作用。
本產(chǎn)品中M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)的濃度為200U/μl，用于體積為20微升的反轉(zhuǎn)錄體系時足夠進行10次反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| D7159-1 | M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-) | 2000U |
| D7159-2 | Reaction Buffer(5X) | 0.2ml |
| － | 說明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃保存。
注意事項：
對于GC含量比較高的RNA的反轉(zhuǎn)錄，試劑盒的使用說明中給予了特別說明，請予以關(guān)注。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1. cDNA第一條鏈的合成(First-strand cDNA Synthesi)：
a. 參考如下表格設(shè)置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：
| 模板(后面3種任選一種) | Total RNA | 0.01-5μg |
| 或Poly(A) RNA/mRNA | 1-500ng | |
| 或Specific RNA | 0.01pg-500ng | |
| 引物(后面3種任選一種) | Oligo(dT)18 | 0.5μg (或100pmol) |
| random hexamer | 0.2μg (或100pmol) | |
| Gene specific primer | 15-25pmol | |
| DEPC-treated Water | － | To 13.7μl* |
| Reaction Buffer (5X) | － | 4μl |
| RNase Inhibitor | － | 0.5μl** |
| dNTP Mix (25 mM each) | － | 0.8μl *** |
| M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-) | － | 1μl |
| 總體積 | 20μl |
To 13.7μl表示加入DEPC-treated Water至最終體積為13.7μl。注意：對于GC含量比較高的RNA模板的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)， 加入DEPC-treated Water混勻后微離心，接著可以在65℃孵育5分鐘，隨后立即置于冰浴以打開RNA的一些比較穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)。
RNase Inhibitor可以視其本身的情況加入適當(dāng)?shù)牧�，例�?.5μl或其他適當(dāng)體積。在加入其他體積時，DEPC-treated Water的用量需適當(dāng)調(diào)整。
dNTP濃度不同時使用的體積需作適當(dāng)調(diào)整，此時DEPC-treated Water的用量需適當(dāng)調(diào)整。
b. 輕輕混勻(可以用Vortex在最低速度輕輕混勻或用移液器吹打混勻)，隨后離心沉淀液體。
c. 如果使用Oligo(dT)18作為引物或使用基因特異性引物，在42℃孵育60分鐘。如果使用rando mhexamer(隨機六聚體)作為引物，先在25℃孵育10分鐘，隨后在42℃孵育60分鐘。注意：對于GC含量比較高的RNA模板的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，可以設(shè)置為45℃孵育60分鐘。
d. 70℃孵育10分鐘以失活 M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)并終止反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。說明：對于長片段的cDNA不推薦采用加 熱的方法失活 M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)，這種操作可能會導(dǎo)致部分長片段 DNA被剪切。
e. 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以直接用于后續(xù)的PCR等反應(yīng)，也可以-20℃凍存以備以后使用。用于后續(xù)PCR反應(yīng)時，如果PCR的反應(yīng)體系為 50微升，則推薦使用2微升反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
2. 其他用途請自行參考M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶(RNase H-)的相關(guān)文獻資料進行。
常見問題：
1. 總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物電泳觀察不到。
反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物由于是從模板反轉(zhuǎn)錄而獲得，而模板的量本身比較低，反轉(zhuǎn)錄的量通常還要少于模板量，因此通�？俁NA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物直接電泳觀察是觀察不到的。
2. 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物通過PCR擴增沒有特異性條帶。
PCR擴增沒有獲得特異性條帶時建議先使用actin、GAPDH等作為內(nèi)參進行PCR擴增，看是否可以成功擴增。如果可以成功，則說明PCR擴增體系沒有問題，此時通常是目的基因的引物設(shè)計欠佳，當(dāng)然也有可能是反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物質(zhì)量欠佳。如果內(nèi)參不能被很好地擴增，則有可能PCR體系存在問題或反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物質(zhì)量欠佳。
