Probe One-Step qRT-PCR Kit是一種基于TaqMan等探針的用于一步法反轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR，即qRT-PCR(Quantitative Reverse Transcription PCR)或real-time RT-PCR的高品質(zhì)預(yù)混液，主要用于RNA的特異性超高靈敏度定量檢測。由于使用的探針一般是TaqMan探針，所以本方法也常稱作TaqMan探針法。
Probe One-Step qRT-PCR Kit以提取的RNA為模版，使用qPCR引物在同一反應(yīng)管內(nèi)連續(xù)進行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR，操作簡單快速，最大限度地減少人為誤差，有效降低污染風險，節(jié)約PCR實驗的操作時間，檢測通量大。
本產(chǎn)品整合了高效的 M-MuLV Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor和優(yōu)異的抗體結(jié)合型熱啟動 Taq DNA Polymerase，并優(yōu)化了緩沖體系，反轉(zhuǎn)錄性能優(yōu)、檢測靈敏度高、擴增特異性強、反應(yīng)穩(wěn)定性好，非常適合于內(nèi)源低豐度RNA、外源病毒RNA等微量RNA的檢測。
檢測原理：探針法qPCR不使用熒光染料如SYBR Green等對PCR產(chǎn)物進行熒光染色，而是采用了熒光基團和淬滅基團(quencher)標記的DNA探針靶向擬通過PCR檢測的目標序列(設(shè)計的探針結(jié)合位點通常位于兩條引物結(jié)合位點之間)。正常情況下，探針上的淬滅基團由于空間上的熒光共振能力轉(zhuǎn)移(FRET)而導致熒光基團淬滅。在PCR反應(yīng)擴增目標序列時，引物和探針都會退火到目標基因上，隨著引物的延伸，Taq酶的5'→3'外切酶活性會導致結(jié)合在目標序列上的探針從5’端開始逐漸被降解。探針的熒光基團和淬滅基團被Taq酶切開后，淬滅基團的作用消失，熒光基團就能正常地被激發(fā)光所激發(fā)而產(chǎn)生熒光了。每經(jīng)過一個PCR循環(huán)，就會有更多的熒光基團被釋放，熒光強度與新合成的目標片段數(shù)量成正比，從而就可以實現(xiàn)定量檢測了。探針通常是目標序列特異性的一段線性DNA，5'端標記FAM或HEX等熒光基團，3'端標記BHQ1、TAMRA或MGB等熒光淬滅基團。
本產(chǎn)品的特異性好、靈敏度高：特異性并不僅僅依賴于PCR引物，探針和目標基因發(fā)生特異性的結(jié)合和降解，才能生成熒光信號，檢測靈敏度和特異性通常要顯著高于使用SYBR Green等熒光染料的方法。
本產(chǎn)品可用于多重檢測：單個反應(yīng)孔中，不同基因?qū)��?yīng)不同探針，不同探針對應(yīng)不同熒光標記，即可進行多重熒光定量PCR檢測。經(jīng)測試，在適當優(yōu)化引物和探針后，本產(chǎn)品可同時用于2-3個基因的檢測。
本產(chǎn)品使用的Taq DNA Polymerase是一種與抗體結(jié)合的高品質(zhì)熱啟動酶，能夠?qū)崿F(xiàn)便捷高效的熱啟動。Taq DNA Polymerase中的Taq酶與抗Taq酶的單克隆抗體相互結(jié)合，從而抑制了Taq酶的DNA聚合酶活性，這樣可以有效避免在低溫條件下由引物和模板DNA非特異性退火或引物二聚體引起的非特異性擴增。在PCR反應(yīng)的預(yù)變性步驟中抗體會被加熱失活，這樣可以確保僅在預(yù)變性后才會把Taq酶的活性釋放出來，預(yù)變性之前不會發(fā)生DNA聚合反應(yīng)，從而大大提高了PCR反應(yīng)的特異性、靈敏度和定量檢測的準確性。
本產(chǎn)品包含了 M-MuLV Reverse Transcriptase、Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTPs、穩(wěn)定劑、Nuclease-free Water、ROX (根據(jù)不同熒光定量PCR儀進行選擇)和鎂離子等所有的通用組分，使操作更簡單、使用更便捷。用戶只需自備引物、探針和樣品RNA即可。
本產(chǎn)品提供了Low ROX和High ROX，廣泛兼容于無需ROX和需要Low ROX或High ROX作為校正染料的熒光定量PCR儀。ROX的作用是用于校正與PCR無關(guān)的熒光波動，從而最大限度減少孔間差異。這種差異可能由多種因素引起，如移液誤差及樣品蒸發(fā)等。不同的熒光定量PCR儀對ROX的要求不同，請根據(jù)實際所用儀器在配制反應(yīng)體系時選擇高濃度ROX (High ROX)、低濃度ROX (Low ROX)或不加ROXProbe。Probe常用儀器所需ROX類型請參考如下表格。

如果用于常規(guī)的96孔板qRT-PCR檢測(建議反應(yīng)體系為20µl)，本產(chǎn)品小包裝D7277S可以進行100次檢測，中包裝D7277M可進行500次檢測；如果用于常規(guī)的384孔板qRT-PCR檢測(建議反應(yīng)體系為10µl)，本產(chǎn)品小包裝D7277S可以進行200次檢測，中包裝D7277M可進行1000次檢測。
包裝清單：

保存條件：
-20℃避光保存，兩年有效。盡量避免反復凍融。
注意事項：
探針的熒光標記須根據(jù)所使用的qPCR儀熒光兼容性來確定。對于需要ROX作為校正染料的熒光定量PCR儀，避免使用ROX標記探針。
用于多重檢測時，需要適當優(yōu)化引物和探針，并使用適當?shù)牟煌瑹晒饣鶊F標記探針，確定效果后再進行多重檢測，一般建議不超過三重檢測。
請注意避免RNase污染，使用RNase-free的槍頭、離心管等。
Probe One-Step Enzyme Mix (10X)含有高濃度甘油，粘度高，使用前將短暫離心至管底，并用移液器輕輕混勻，混勻過程中盡量避免產(chǎn)生氣泡，然后緩慢準確吸取。
使用前需確保Probe One-Step Reaction Buffer (2X)完全融化，上下顛倒輕輕混勻后使用。
如果擴增片段較長或者RNA結(jié)構(gòu)較為復雜，可將模板RNA在65℃預(yù)處理5-10分鐘，可提高反轉(zhuǎn)錄效率。
本反應(yīng)使用qPCR的Reverse Primer作為反轉(zhuǎn)錄的基因特異性引物，不能使用Random Hexamer Primer或Oligo(dT) Primer等常用于cDNA第一鏈合成的引物。
注意引物退火溫度，當退火溫度<60℃時，推薦使用三步法PCR擴增。
對于超過350bp或者高GC含量的擴增片段，建議增加延伸時間至60秒或者采用三步法以提高擴增效率。
經(jīng)測試，本產(chǎn)品反復凍融10次對使用效果無顯著影響。但仍需盡量避免反復凍融本產(chǎn)品，反復凍融可能使產(chǎn)品性能下降。
qPCR檢測是超高靈敏度的檢測，PCR反應(yīng)設(shè)置區(qū)域需盡量避免各種可能的待擴增產(chǎn)物的污染。PCR產(chǎn)物宜密封后丟棄，以避免超高濃度的PCR產(chǎn)物污染實驗環(huán)境。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.One-Step qRT-PCR反應(yīng)體系的設(shè)置：
a.融解并混勻One-Step qRT-PCR反應(yīng)所需的各種溶液，置于冰浴上或冰盒內(nèi)。
b.參考下表在室溫或冰浴上設(shè)置One-Step qRT-PCR反應(yīng)體系(以96孔板，每孔反應(yīng)體系為20μl為例)：

注意：
(1)當檢測樣品比較多時，可根據(jù)樣品數(shù)量先配制所需的相同試劑的混合液，一般多配制5-10%，然后再分裝到每個反應(yīng)孔中，最后再在每個反應(yīng)孔中加入不同的試劑，這樣可使所取的試劑體積更準確更均一，誤差更小，并減少試劑損失。例如：檢測的目的RNA相同，而RNA樣品不同，則可以把除RNA樣品外的所有試劑根據(jù)樣品數(shù)量配制在一起，然后分液至每個反應(yīng)孔中，最后再加入不同的模板RNA。
(2)通常引物的終濃度為0.2-0.5μM時可獲得良好的檢測效果，也可根據(jù)情況在0.1-1.0μM范圍內(nèi)調(diào)整引物的終濃度。
(3)最佳的探針(probe)濃度，與使用的熒光定量PCR儀、探針種類、熒光標記物質(zhì)種類有關(guān)。實際使用時請參考儀器說明書，或各熒光探針的具體使用要求進行探針濃度的調(diào)節(jié)。通常探針的濃度宜低于引物的濃度，例如引物終濃度為0.3μM ，則推薦的探針終濃度為0.2μM，可在0.1-0.3μM范圍內(nèi)調(diào)整探針的終濃度。
(4)通常RNA模板的量以1pg-2µg為參考用量，一般總RNA為100ng-1µg。因不同物種的模板中含有RNA的拷貝數(shù)不同，如有必要，可對模板RNA進行梯度稀釋，以確定最佳的模板RNA使用量。同時，由于qPCR靈敏度極高, 建立反應(yīng)體系時加入RNA模板量的準確程度對最終定量結(jié)果會有很大的影響，因此建議將模板RNA適當稀釋后加入反應(yīng)體系中，比如每個20μl反應(yīng)體系2-5µl，這樣可以有效提高實驗的重復性。
(5)不同的熒光定量PCR儀對ROX的要求不同，請根據(jù)實際所用儀器在配制反應(yīng)體系時選擇高濃度ROX (High ROX)、低濃度ROX (Low ROX)或不加ROX。
(6)96孔板的推薦反應(yīng)體系為20µl，也可以根據(jù)實際實驗需求，按比例擴大或縮小反應(yīng)體系。
(7)建議設(shè)置不加模板RNA的陰性對照組。
c.用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
d.將設(shè)置好的PCR反應(yīng)管或PCR反應(yīng)板置于熒光定量PCR儀上，開始PCR反應(yīng)。
2.One-Step qRT-PCR反應(yīng)程序：
50℃ 15分鐘一般可以得到理想的反轉(zhuǎn)錄效果，但如果片段較長，也可以增加至30分鐘。在Real-time PCR反應(yīng)前進行模板的預(yù)變性，通常設(shè)定為95℃ 2分鐘，復雜或高GC模板適當延長時間至5分鐘。本產(chǎn)品中的Taq DNA Polymerase可以在15秒內(nèi)可完成至少300bp的擴增，可以滿足絕大多數(shù)的qPCR實驗；對于超過350bp或者高GC含量的擴增子，建議增加延伸時間至60秒或者采用三步法以提高擴增效率。建議采用如下的PCR程序，本程序是以ABI 7900HT熒光定量PCR儀為例：
a.反轉(zhuǎn)錄：50℃ 15-30min
b.預(yù)變性：95℃ 2min
c.變性：95℃ 15sec
d.退火/延伸：60℃ 15-30sec
e.重復步驟c和步驟d，總共40個循環(huán)
f.熔解曲線分析(可選)：95℃ 15sec, 60℃ 15sec, 95℃ 15sec
g.使用熒光定量PCR儀提供的軟件分析結(jié)果
三步法只需在退火/延伸后加一步72℃ 30sec，隨后重復步驟c、d及增加的這一步驟共40個循環(huán)即可。
注：以上舉例為常規(guī)qPCR反應(yīng)系統(tǒng)，僅供參考。實際反應(yīng)條件因模板、引物等的結(jié)構(gòu)不同而各異，需根據(jù)模板、引物、目的片段的特點設(shè)定最佳反應(yīng)條件，并根據(jù)比例放大或縮小反應(yīng)體系。

常見問題：
1.熒光定量PCR結(jié)果不理想，出現(xiàn)特異性不好或擴增效率不高時，可能是由于以下原因造成：
a.樣品RNA發(fā)生降解。此時可以通過RNA電泳等方法確認所使用的RNA樣品是否發(fā)生明顯的降解，在反轉(zhuǎn)錄實驗前的實驗操作過程中需要嚴格注意無RNA酶的實驗操作。
b.引物設(shè)計不佳。請選擇適當?shù)囊�物設(shè)計軟件進行引物設(shè)計，注意引物的GC含量、二級結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。也可以嘗試使用有文獻報道使用過的引物，或者從訂購經(jīng)過測試的qPCR引物。
c.待擴增片段GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會變得相對比較困難，此時宜更換引物。
d.PCR反應(yīng)體系在室溫設(shè)置時容易導致非特異性條帶，但在使用熱啟動酶時可以有效避免室溫操作導致的非特異性條帶的產(chǎn)生。但對于一些較難擴增的產(chǎn)物，可以嘗試在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)體系，以進一步減少非特異性的DNA擴增。
e.退火溫度不佳，需要優(yōu)化。這種情況下宜更換引物。
f.待擴增片段GC含量較高或長度較長，變性不夠充分。此時宜更換引物，使待擴增片段的GC含量和長度適中。
g.模板量太低，此時宜適當加大模板量。
h.模板中含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，可以用適當?shù)腄NA純化方法例如柱純化等純化模板DNA。
2.反應(yīng)條件優(yōu)化方法：
a.引物濃度：通常引物終濃度為0.2μM時可獲得良好檢測效果，終濃度可以在0.1-1.0μM范圍內(nèi)適當調(diào)整。如果希望提高反應(yīng)特異性，可降低引物濃度；如果希望提高擴增效率，可增加引物的濃度，從而優(yōu)化反應(yīng)體系。
b.退火溫度：建議采用兩步法PCR，退火溫度60℃進行反應(yīng)。如果希望提高反應(yīng)特異性，可提高退火溫度，以60-64℃作為退火溫度的調(diào)整范圍。在引物Tm值較低而得不到良好的實驗結(jié)果時，可嘗試進行三步法PCR擴增，三步法的退火溫度請以56-64℃作為溫度設(shè)置的參考范圍。
c.延伸時間：建議采用兩步法PCR，延伸15-30秒。對于超過350bp或者高GC含量的擴增子，建議增加延伸時間至60秒或者采用三步法以提高擴增效率。

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