本試劑盒提供了染色增強劑，使細胞膜染色更加快速，熒光染色更加明亮，染色背景更低。

本試劑盒除了最簡單的細胞膜熒光標記外，還可以用于檢測細胞的融合和粘附，檢測發(fā)育或移植過程中細胞遷移，通過FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)檢測脂在細胞膜上的擴散，檢測細胞毒性和標記脂蛋白等。

本試劑盒可以直接染色活的細胞或組織，染色時間通常為5-20分鐘。對于固定的細胞或組織，通常宜使用配制在PBS中的4%多聚甲醛進行固定，使用其它不適當?shù)墓潭ㄒ簳��?dǎo)致熒光背景較高。本試劑盒對HeLa細胞的染色效果參考圖2。

圖2. 細胞膜綠色熒光染色試劑盒(DiO)對HeLa細胞的染色效果。DiO的染色時間為10分鐘。

DiO染色后可以兼容免疫熒光實驗。建議使用免疫染色通透液(Saponin) (P0095)或使用洋地黃皂苷(ST1272)配制的不會溶解細胞膜的通透液進行通透，其它去垢劑配制的通透液可能會溶解細胞膜上的脂類物質(zhì)，造成DiO失去結(jié)合位置，最終導(dǎo)致DiO的染色失效。但通透也可能會影響DiO在細胞膜上的定位并會增加細胞內(nèi)的染色，具體實驗中需根據(jù)實驗的需求選擇合適的細胞通透液。

本試劑盒小包裝C1993S，如果用于流式細胞儀，每個樣品的檢測體系體積為0.5ml時，可以進行200次檢測；96孔板每孔檢測體系的體積為100μl時可以進行1000次檢測。

包裝清單：

保存條件：

-20℃避光保存，一年有效。染色增強劑(400X)和染色緩沖液也可保存在4℃。

注意事項：

熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

染色緩沖液經(jīng)過過濾除菌處理，在使用時須注意避免微生物污染，否則很可能嚴重影響染色效果。如果染色緩沖液發(fā)生渾濁等明顯的微生物污染，就不能繼續(xù)使用。

如果染色時間過長或染色后細胞繼續(xù)培養(yǎng)，探針也可能進入細胞內(nèi)而染色其它細胞器的膜。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.溶液制備：
a.細胞膜染色工作液的用量：對于6、12、24、96孔板，每孔的細胞膜染色工作液分別為1~2ml、0.5~1ml、300~500μl和50~100μl；對于流式細胞樣品，每個樣品的細胞膜染色工作液為0.5ml；對于切片，可以根據(jù)切片大小，每個切片使用100-200μl的細胞膜染色工作液。
b.細胞膜染色工作液的配制：根據(jù)樣品數(shù)量和每個樣品所需工作液的體積，計算出細胞膜染色工作液的總體積。以流式細胞儀檢測為例，每個樣品的細胞膜染色工作液為0.5ml，參照下表配制細胞膜染色工作液。
注意：請嚴格按照下表中組分順序和體積配制細胞膜染色工作液，且DiO (400X)和染色增強劑(400X)混勻后再加入染色緩沖液。對于活細胞染色的情況，如果細胞對于培養(yǎng)條件非常敏感，也可以使用正常的細胞培養(yǎng)液代替本試劑盒提供的染色緩沖液用于配制細胞膜染色工作液。使用正常的細胞培養(yǎng)液替代染色緩沖液的情況，可能會導(dǎo)致染色效果有所下降，此時需要適當考慮延長染色時間或加大DiO染料濃度。

注：不同細胞的最佳染色濃度略有不同，細胞膜染色工作液的最終濃度建議根據(jù)不同細胞系和實驗體系進行優(yōu)化，可在1:100-1:400之間進行調(diào)整。DiO的最終濃度提高時，染色增強劑的用量不變。
2.懸浮活細胞染色：
a.加入適當體積的細胞膜染色工作液重懸細胞，使其密度為1-2×106/ml左右。
b.37℃避光孵育細胞5-20min，不同的細胞最佳孵育時間不同。以5min作為初始孵育時間，根據(jù)實際所用的細胞優(yōu)化染色時間，以得到最佳的熒光染色效果。
c.500-1000×g室溫離心5min。
d.吸除上清液，再次緩慢加入37℃預(yù)熱的細胞培養(yǎng)液重懸細胞。
e.重復(fù)c、d步驟兩次。
f.流式細胞儀檢測，或?qū)⒓毎�轉(zhuǎn)移至多孔板、細胞培養(yǎng)皿或者細胞爬片上，在熒光顯微鏡下觀察。DiO的最大激發(fā)光波長為484nm，最大發(fā)射光波長為501nm。
3.貼壁活細胞染色：
a.將貼壁細胞種于細胞培養(yǎng)皿、多孔細胞培養(yǎng)板或者細胞爬片上。
b.吸除細胞培養(yǎng)液，用Hanks' Balanced Salt Solution (C0218或C0219)或PBS (C0221A、C0221D或C0221G)洗滌細胞2遍。
c.加入適當體積的細胞膜染色工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細胞。
d.37℃避光孵育細胞5-20min，不同的細胞最佳培養(yǎng)時間不同。以5min作為初始孵育時間，根據(jù)實際所用的細胞優(yōu)化染色時間，以得到最佳的熒光染色效果。
e.吸除細胞膜染色工作液，用Hanks' Balanced Salt Solution或PBS洗滌2-3次，然后加入37℃預(yù)熱的細胞培養(yǎng)液即可在熒光顯微鏡下觀察。DiO的最大激發(fā)光波長為484nm，最大發(fā)射光波長為501nm。
4.染色后的固定和通透：
a.固定：如果樣品需要進一步進行免疫熒光實驗，建議使用免疫染色固定液(P0098)或4%多聚甲醛固定液(P0099)進行固定。
b.通透：建議使用0.1% Triton X-100 (ST795)或洋地黃皂苷(ST1272)進行通透。但通透可能會影響DiO在細胞膜的定位并會增加細胞內(nèi)的染色，具體實驗中需根據(jù)實驗的需求選擇合適的細胞通透液。
注：如果需要封片，建議直接用PBS進行封片。請避免使用含有甘油或其它有機物的封片劑，否則會影響染色并增加熒光背景。
5.固定后細胞或切片的染色：
a.使用4%多聚甲醛固定液(P0099)或免疫染色固定液(P0098)進行固定。
b.吸除固定液，用PBS洗滌細胞3遍。
c.選做：使用配制在PBS中的0.1% Triton X-100 (ST795)進行通透，室溫10min。然后用PBS洗滌細胞3遍。
d.選做：按照免疫染色的方法進行抗體的孵育或用其它染料進行染色。注意：抗體孵育步驟中的封閉液、抗體稀釋液及洗滌液不能含有去垢劑。
e.加入適當體積的細胞膜染色工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細胞或樣品。
f.37℃避光孵育5-20min，最佳染色時間需要根據(jù)自己的實驗條件摸索，以達到最佳的熒光染色效果。
g.吸除細胞膜染色工作液，用PBS洗滌2-3次，隨后即可在熒光顯微鏡下觀察。DiO的最大激發(fā)光波長為484nm，最大發(fā)射光波長為501nm。​