細(xì)胞膜遠(yuǎn)紅外熒光染色試劑盒(DiD)，Cell Plasma Membrane Staining Kit with DiD (Far-red Fluorescence)是一種以DiD為熒光探針，并提供了染色增強(qiáng)劑、能快速靈敏地對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行遠(yuǎn)紅外熒光染色標(biāo)記的試劑盒。

DiD即DiIC18(5)，也稱為DiD' solid，全稱為1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine,4-Chlorobenzenesulfonate Salt，分子式為C67H103ClN2O3S，分子量為1052.08。DiD是DiI的類似物，但具有更長(zhǎng)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，為遠(yuǎn)紅外熒光，在一些細(xì)胞和組織染色中更有優(yōu)勢(shì)，特別適合用于進(jìn)行多種熒光的同時(shí)染色。DiD是一種親脂性羰花青(carbocyanine)染料，具有很長(zhǎng)的親脂性烴鏈，進(jìn)入細(xì)胞膜后可以側(cè)向擴(kuò)散逐漸使整個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞膜被染色，染色后非常穩(wěn)定。

DiD可被633nm的氦-氖(He-Ne)激光所激發(fā)，DiD在進(jìn)入細(xì)胞膜之前熒光非常弱，僅當(dāng)進(jìn)入到細(xì)胞膜后才可以被激發(fā)出很強(qiáng)的熒光。DiD被激發(fā)后可以發(fā)出遠(yuǎn)紅外的熒光，DiD和磷酯雙層膜結(jié)合后的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考圖1。其中，最大激發(fā)波長(zhǎng)為644nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為665nm。

圖1. DiD和磷酯雙層膜結(jié)合后的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。

DiD被廣泛用于正向或逆向的、活的或固定的神經(jīng)等細(xì)胞或組織的示蹤劑或長(zhǎng)期示蹤劑(long-term tracer)。DiD毒性很低，通常不會(huì)影響細(xì)胞的生存力(viability)。

本試劑盒提供了染色增強(qiáng)劑，使細(xì)胞膜染色更加快速，熒光染色更加明亮，染色背景更低。

本試劑盒除了最簡(jiǎn)單的細(xì)胞膜熒光標(biāo)記外，還可以用于檢測(cè)細(xì)胞的融合和粘附，檢測(cè)發(fā)育或移植過(guò)程中細(xì)胞遷移，通過(guò)FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)檢測(cè)脂在細(xì)胞膜上的擴(kuò)散，檢測(cè)細(xì)胞毒性和標(biāo)記脂蛋白等。

本試劑盒可以直接染色活的細(xì)胞或組織，染色時(shí)間通常為5-20分鐘。對(duì)于固定的細(xì)胞或組織，通常宜使用配制在PBS中的4%多聚甲醛進(jìn)行固定，使用其它不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ簳?huì)導(dǎo)致熒光背景較高。本試劑盒對(duì)HeLa細(xì)胞的染色效果參考圖2。

圖2. 細(xì)胞膜遠(yuǎn)紅外熒光染色試劑盒(DiD)對(duì)HeLa細(xì)胞的染色效果。DiD的染色時(shí)間為10分鐘。

DiD染色后可以兼容免疫熒光實(shí)驗(yàn)。建議使用免疫染色通透液(Saponin) (P0095)或使用洋地黃皂苷(ST1272)配制的不會(huì)溶解細(xì)胞膜的通透液進(jìn)行通透，其它去垢劑配制的通透液可能會(huì)溶解細(xì)胞膜上的脂類物質(zhì)，造成DiD失去結(jié)合位置，最終導(dǎo)致DiD的染色失效。但通透也可能會(huì)影響DiD在細(xì)胞膜上的定位并會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)的染色，具體實(shí)驗(yàn)中需根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需求選擇合適的細(xì)胞通透液。

本試劑盒小包裝C1995S，如果用于流式細(xì)胞儀，每個(gè)樣品的檢測(cè)體系體積為0.5ml時(shí)，可以進(jìn)行200次檢測(cè)；96孔板每孔檢測(cè)體系的體積為100μl時(shí)可以進(jìn)行1000次檢測(cè)。

包裝清單：

保存條件：

-20℃避光保存，一年有效。染色增強(qiáng)劑(400X)和染色緩沖液也可保存在4℃。

注意事項(xiàng)：

熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

染色緩沖液經(jīng)過(guò)過(guò)濾除菌處理，在使用時(shí)須注意避免微生物污染，否則很可能嚴(yán)重影響染色效果。如果染色緩沖液發(fā)生渾濁等明顯的微生物污染，就不能繼續(xù)使用。

如果染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或染色后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，探針也可能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而染色其它細(xì)胞器的膜。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說(shuō)明：
1.溶液制備：
a.細(xì)胞膜染色工作液的用量：對(duì)于6、12、24、96孔板，每孔的細(xì)胞膜染色工作液分別為1~2ml、0.5~1ml、300~500μl和50~100μl；對(duì)于流式細(xì)胞樣品，每個(gè)樣品的細(xì)胞膜染色工作液為0.5ml；對(duì)于切片，可以根據(jù)切片大小，每個(gè)切片使用100-200μl的細(xì)胞膜染色工作液。
b.細(xì)胞膜染色工作液的配制：根據(jù)樣品數(shù)量和每個(gè)樣品所需工作液的體積，計(jì)算出細(xì)胞膜染色工作液的總體積。以流式細(xì)胞儀檢測(cè)為例，每個(gè)樣品的細(xì)胞膜染色工作液為0.5ml，參照下表配制細(xì)胞膜染色工作液。
注意：請(qǐng)嚴(yán)格按照下表中組分順序和體積配制細(xì)胞膜染色工作液，且DiD (400X)和染色增強(qiáng)劑(400X)混勻后再加入染色緩沖液。對(duì)于活細(xì)胞染色的情況，如果細(xì)胞對(duì)于培養(yǎng)條件非常敏感，也可以使用正常的細(xì)胞培養(yǎng)液代替本試劑盒提供的染色緩沖液用于配制細(xì)胞膜染色工作液。使用正常的細(xì)胞培養(yǎng)液替代染色緩沖液的情況，可能會(huì)導(dǎo)致染色效果有所下降，此時(shí)需要適當(dāng)考慮延長(zhǎng)染色時(shí)間或加大DiD染料濃度。

注：不同細(xì)胞的最佳染色濃度略有不同，細(xì)胞膜染色工作液的最終濃度建議根據(jù)不同細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)體系進(jìn)行優(yōu)化，可在1:100-1:400之間進(jìn)行調(diào)整。DiD的最終濃度提高時(shí)，染色增強(qiáng)劑的用量不變。
2.懸浮活細(xì)胞染色：
a.加入適當(dāng)體積的細(xì)胞膜染色工作液重懸細(xì)胞，使其密度為1-2×106/ml左右。
b.37℃避光孵育細(xì)胞5-20min，不同的細(xì)胞最佳孵育時(shí)間不同。以5min作為初始孵育時(shí)間，根據(jù)實(shí)際所用的細(xì)胞優(yōu)化染色時(shí)間，以得到最佳的熒光染色效果。
c.500-1000×g室溫離心5min。
d.吸除上清液，再次緩慢加入37℃預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。
e.重復(fù)c、d步驟兩次。
f.流式細(xì)胞儀檢測(cè)，或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)移至多孔板、細(xì)胞培養(yǎng)皿或者細(xì)胞爬片上，在熒光顯微鏡下觀察。DiD的最大激發(fā)光波長(zhǎng)為644nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為665nm。
3.貼壁活細(xì)胞染色：
a.將貼壁細(xì)胞種于細(xì)胞培養(yǎng)皿、多孔細(xì)胞培養(yǎng)板或者細(xì)胞爬片上。
b.吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用Hanks' Balanced Salt Solution (C0218或C0219)或PBS (C0221A、C0221D或C0221G)洗滌細(xì)胞2遍。
c.加入適當(dāng)體積的細(xì)胞膜染色工作液，輕輕晃動(dòng)使染料均勻覆蓋所有細(xì)胞。
d.37℃避光孵育細(xì)胞5-20min，不同的細(xì)胞最佳培養(yǎng)時(shí)間不同。以5min作為初始孵育時(shí)間，根據(jù)實(shí)際所用的細(xì)胞優(yōu)化染色時(shí)間，以得到最佳的熒光染色效果。
e.吸除細(xì)胞膜染色工作液，用Hanks' Balanced Salt Solution或PBS洗滌2-3次，然后加入37℃預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液即可在熒光顯微鏡下觀察。DiD的最大激發(fā)光波長(zhǎng)為644nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為665nm。
4.染色后的固定和通透：
a.固定：如果樣品需要進(jìn)一步進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，建議使用免疫染色固定液(P0098)或4%多聚甲醛固定液(P0099)進(jìn)行固定。
b.通透：建議使用0.1% Triton X-100 (ST795)或洋地黃皂苷(ST1272)進(jìn)行通透。但通透可能會(huì)影響DiD在細(xì)胞膜的定位并會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)的染色，具體實(shí)驗(yàn)中需根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需求選擇合適的細(xì)胞通透液。
注：如果需要封片，建議直接用PBS進(jìn)行封片。請(qǐng)避免使用含有甘油或其它有機(jī)物的封片劑，否則會(huì)影響染色并增加熒光背景。
5.固定后細(xì)胞或切片的染色：
a.使用4%多聚甲醛固定液(P0099)或免疫染色固定液(P0098)進(jìn)行固定。
b.吸除固定液，用PBS洗滌細(xì)胞3遍。
c.選做：使用配制在PBS中的0.1% Triton X-100 (ST795)進(jìn)行通透，室溫10min。然后用PBS洗滌細(xì)胞3遍。
d.選做：按照免疫染色的方法進(jìn)行抗體的孵育或用其它染料進(jìn)行染色。注意：抗體孵育步驟中的封閉液、抗體稀釋液及洗滌液不能含有去垢劑。
e.加入適當(dāng)體積的細(xì)胞膜染色工作液，輕輕晃動(dòng)使染料均勻覆蓋所有細(xì)胞或樣品。
f.37℃避光孵育5-20min，最佳染色時(shí)間需要根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)條件摸索，以達(dá)到最佳的熒光染色效果。
g.吸除細(xì)胞膜染色工作液，用PBS洗滌2-3次，隨后即可在熒光顯微鏡下觀察。DiD的最大激發(fā)光波長(zhǎng)為644nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為665nm。​