YO-PRO-1/PI細胞凋亡與壞死檢測試劑盒(Apoptosis and Necrosis Detection Kit with YO-PRO-1and PI)，簡稱YP1/PI細胞凋亡與壞死檢測試劑盒，是一種基于DNA綠色熒光染料YO-PRO-1 (YP1)和紅色熒光染料碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)的雙熒光法檢測細胞凋亡和壞死的試劑盒。本試劑盒適用于熒光顯微鏡、流式細胞儀、熒光酶標(biāo)儀及其它熒光檢測系統(tǒng)。

YO-PRO-1，又名惡唑黃(Oxazole yellow)，簡稱YP1，是一種對正常動物細胞膜沒有通透性而對于凋亡細胞的細胞膜有通透性的DNA綠色熒光染料，常用于細胞凋亡的檢測。YO-PRO-1是一種非細胞膜穿透性的并對DNA具有高親和力的羰花青單體綠色熒光染料，在沒有與DNA結(jié)合的時候基本上沒有熒光，而與DNA結(jié)合后可以發(fā)出明亮的綠色熒光。在細胞凋亡發(fā)生時，細胞膜通透性發(fā)生改變，此時YO-PRO-1可以進入細胞內(nèi)與DNA結(jié)合，發(fā)出明亮的綠色熒光，因此常使用本熒光染料用于分析和鑒定凋亡細胞。需要注意的是YO-PRO-1也能染色壞死細胞，因此需要和對壞死細胞特異性熒光染色的PI進行雙染才能有效判定細胞凋亡。

PI，即碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一種核酸紅色熒光染料，只能染色細胞膜完整性喪失的壞死細胞，并與核酸結(jié)合發(fā)出明亮的紅色熒光。因此， YO-PRO-1與碘化丙啶(PI)聯(lián)合使用，可以同時進行凋亡細胞和壞死細胞的檢測，凋亡細胞呈現(xiàn)綠色熒光，壞死細胞同時呈現(xiàn)紅色和綠色熒光陽性，活細胞很少或幾乎沒有熒光。

細胞死亡包括凋亡(apoptosis)、壞死(necrosis)、焦亡(pyroptosis)等多種形式。其中受調(diào)控的細胞死亡被稱為程序性細胞死亡(programmed cell death, PCD)。程序性細胞死亡包括凋亡、細胞程序性壞死(programmed necrosis)或壞死性凋亡(necroptosis)和焦亡等。從細胞膜的完整性角度來看，凋亡的特征是細胞膜的完整性會保留，而壞死的特征是細胞膜的完整性會喪失。

細胞凋亡是生物體發(fā)育等生命過程中普遍存在的、由基因決定的細胞主動有序的死亡方式。當(dāng)細胞遇到內(nèi)、外環(huán)境因子刺激時，啟動基因調(diào)控的自殺保護措施，去除體內(nèi)非必需細胞或即將發(fā)生特化的細胞。在這一過程中，細胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體，并迅速被巨噬細胞或鄰近細胞清除，不會導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，這是一種由基因控制、高度有序的細胞自主死亡，包含一系列信號事件組成的通路。細胞凋亡的主要特征包括細胞膜保持完整、細胞膜磷脂酰絲氨酸外翻(Annexin V染色陽性)、基因組DNA片段化(DNA fragmentation) (即產(chǎn)生DNA ladder并且TUNEL染色陽性)、電鏡或熒光染色時細胞核碎裂或致密濃染、Caspase 3等激活、線粒體膜電位下降、細胞色素C從線粒體內(nèi)釋放等。

壞死通常被認為是一種偶發(fā)性的并且是被動的細胞死亡，如物理性或化學(xué)性的損害因素及缺氧與營養(yǎng)不良等都可以導(dǎo)致細胞壞死。壞死細胞初期細胞膜通透性增高，致使細胞腫脹，細胞器變形或腫大，早期細胞核無明顯形態(tài)學(xué)變化，最后細胞破裂，細胞膜喪失完整性，釋放出細胞內(nèi)容物，并常引起炎癥反應(yīng)，但不會出現(xiàn)細胞凋亡或自噬標(biāo)志物。通常，凋亡對生命體是有利的，而壞死很可能是有害甚至是致命的。凋亡的晚期也可以發(fā)生繼發(fā)性壞死(secondary necrosis)。受細胞程序性調(diào)控的壞死(programmed necrosis)被稱為necropotosis。

YO-PRO-1與DNA結(jié)合后的最大激發(fā)光波長為491nm，最大發(fā)射波長為509nm；PI與DNA結(jié)合后的最大激發(fā)光波長為535nm，最大發(fā)射光波長為617nm。YO-PRO-1、PI與DNA結(jié)合后的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考圖1。

圖1. YO-PRO-1、PI與DNA結(jié)合后的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。

本試劑盒作為一種細胞凋亡和壞死檢測試劑盒，可以應(yīng)用于大多數(shù)的哺乳動物細胞，包括貼壁細胞和懸浮細胞，與傳統(tǒng)的Annexin V-FITC/PI檢測方法相比，檢測準確性和靈敏度相當(dāng)。本試劑盒用于檢測細胞凋亡與細胞壞死的效果參考圖2。

圖2.YO-PRO-1/PI細胞凋亡與壞死檢測試劑盒檢測MOLM13 (人急性髓原白血病細胞)細胞凋亡與壞死的效果。正常狀態(tài)的MOLM13細胞在明場下的形態(tài)見圖A；正常細胞不會被YO-PRO-1以及PI染色(圖B-D)。50μM Camptothecin誘導(dǎo)7小時后的MOLM13細胞在明場下的形態(tài)見圖E；此時細胞產(chǎn)生明顯的凋亡，凋亡細胞的細胞核被YO-PRO-1染色為綠色熒光(圖F)；壞死細胞的細胞核則同時被YO-PRO-1和PI染色，紅色熒光和綠色熒光重疊呈現(xiàn)橙黃色 (圖G)。實際檢測效果會因?qū)嶒灄l件、檢測儀器的不同而存在差異，本圖僅供參考。

本試劑盒提供的YO-PRO-1和PI為1000X溶液，使用非常便捷。為了得到比較理想的染色結(jié)果，請根據(jù)細胞類型和實驗實際情況對探針染色液的稀釋倍數(shù)進行適當(dāng)調(diào)整。YO-PRO-1的工作濃度一般為0.5-5X，推薦使用濃度為1X；PI的工作濃度為0.1-4X，推薦使用濃度為1X。同時，本試劑盒配套提供的檢測緩沖液可在一段時間內(nèi)維持細胞的正常狀態(tài)， 并給細胞提供一定的營養(yǎng)，效果通常比PBS或HBSS更好。

本試劑盒小包裝C1075S和中包裝C1075M用于流式細胞儀，每個樣品使用0.5ml的檢測工作液，可以分別進行100次和500次檢測；用于96孔板每孔檢測體系的體積為100μl時可以分別可以檢測500次和2500次，檢測體系體積為200μl時可以分別可以檢測250次和1250次。實際檢測次數(shù)會因為檢測體系的大小和所使用底物濃度的高低而有所不同。

包裝清單：

保存條件：

-20℃避光保存，至少1年有效。C1075-3檢測緩沖液也可4℃保存。

注意事項：

熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

檢測緩沖液應(yīng)在無菌環(huán)境中使用，否則可能會被微生物污染而影響使用效果，甚至無法繼續(xù)使用。

兩種熒光探針首次使用時，可以適當(dāng)分裝后在-20℃避光保存，適當(dāng)避免反復(fù)凍融。

YP1和PI對人體有刺激性，操作時請小心，并注意適當(dāng)防護以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.YP1/PI檢測工作液準備：
a.YP1/PI檢測工作液的用量：對于6、12、24、96孔板，每孔YP1/PI檢測工作液的用量分別為0.5~1ml、200~500μl、100~200μl和50~100μl；對于流式細胞樣品，每個樣品的YP1/PI檢測工作液的體積為0.5ml。
b.YP1/PI檢測工作液的配制：根據(jù)樣品數(shù)量和每個樣品所需工作液的體積，計算出YP1/PI檢測工作液的總體積。以流式細胞儀檢測為例，每個樣品的YP1/PI檢測工作液的體積為0.5ml，參考下表配制YP1/PI檢測工作液。

注1：本試劑盒中提供的檢測緩沖液在一段時間內(nèi)可以維持細胞的正常狀態(tài)，并給細胞提供一定的營養(yǎng)，效果通常比PBS或HBSS更好，也可以用其它合適的溶液，如無血清培養(yǎng)液代替。
注2：檢測工作液中的YP1和PI的最終濃度需根據(jù)不同細胞系和實驗體系通過預(yù)實驗進行優(yōu)化。
2.熒光顯微鏡檢測：
a.接種培養(yǎng)。將細胞接種于96孔板等多孔板、細胞培養(yǎng)皿中或者細胞爬片上，按實驗設(shè)計對細胞進行一定處理。
b.洗滌(選做)。對于貼壁細胞，吸除培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞1次；對于懸浮細胞，250-1000×g室溫離心5min，吸除上清，用PBS洗滌1次。酚紅或血清對于本試劑盒的檢測有一定的干擾。在能充分吸凈殘留液體的情況下，可以不使用PBS洗滌。
c.染色。加入適當(dāng)體積的YP1/PI檢測工作液。通常96孔板每孔加入100μl，24孔板每孔加入250μl，12孔板每孔加入500μl，6孔板每孔加入1ml。37℃避光孵育5-20min。不同的細胞最佳孵育時間有所不同，以5min作為初始孵育時間，后續(xù)可以根據(jù)實際染色效果對染色時間進行適當(dāng)調(diào)整和優(yōu)化，以得到更加理想的染色效果。
d.檢測。孵育結(jié)束后，在熒光顯微鏡下觀察熒光染色效果(YP1染色陽性細胞為綠色熒光，Ex/Em=491/509nm；PI染色陽性細胞為紅色熒光，Ex/Em=535/617nm)。對于懸浮細胞MOLM13，本產(chǎn)品的熒光檢測效果參考圖2。如有需要，也可進一步進行其它熒光的復(fù)染，例如使用Hoechst 33342活細胞染色液(C1027-C1029)染色細胞核等。注意整個過程均需注意避光操作。
3.流式細胞儀檢測：
a.細胞準備。貼壁細胞胰酶消化后用培養(yǎng)液重懸，并用PBS洗滌一次；懸浮細胞250-1000×g室溫離心5min，棄上清，用PBS洗滌一次。每個樣品推薦的細胞用量為106個細胞。
b.染色。對于上一步驟的106個細胞的沉淀，加入0.5ml YP1/PI檢測工作液，重懸為單細胞懸液。37℃避光孵育20min。注：需要準備好僅含緩沖液的細胞樣品用作流式細胞儀檢測時的陰性對照，該緩沖液與配制YP1/PI檢測工作液的緩沖液宜保持一致。同時準備兩管額外的細胞樣品，每管只加入一種染料(YP1或PI)，用于流式單染的補償調(diào)節(jié)。
c.檢測。孵育完成后，可以直接進行流式細胞儀檢測，也可以250-1000×g室溫離心5min沉淀細胞，吸凈液體后每個樣品加入1ml檢測緩沖液重懸細胞后用流式細胞儀檢測(YP1染色陽性細胞為綠色熒光，Ex/Em=491/509nm；PI染色陽性細胞為紅色熒光，Ex/Em=535/617nm)。如有需要，也可進行進一步的染色，例如使用Hoechst 33342活細胞染色液(C1027-C1029)染色細胞核等。注意整個過程均需注意避光操作。染色后，將樣品置于冰上，并盡量在1小時內(nèi)進行流式細胞儀檢測和分析。
注1：使用僅含檢測緩沖液的并且未經(jīng)染色的細胞樣品用于流式細胞儀的陰性對照設(shè)置。
注2：細胞圈門(gate)時，注意不要圈入細胞碎片，并使用YP1或PI單染的細胞進行調(diào)節(jié)補償。雙染細胞流式檢測應(yīng)獲得兩個相對獨立的細胞群：綠色熒光的凋亡細胞群和紅色熒光陽性或者紅色熒光和綠色熒光雙陽性的壞死細胞群。壞死細胞的綠色熒光染色通常會比較弱一些。
注3：由于流式檢測比較靈敏，使用的熒光探針濃度可能要比熒光顯微鏡檢測時要低，此時可根據(jù)細胞類型和實際染色情況對YP1或PI的稀釋倍數(shù)進行適當(dāng)調(diào)整。
4.熒光酶標(biāo)儀檢測細胞死活的變化：
a.接種培養(yǎng)。將細胞接種于96孔板黑色多孔板中，如BeyoGold™全黑96孔細胞培養(yǎng)板(FCP966)，每孔的細胞數(shù)需要控制在100-10,000個，通常宜在2000-5000個范圍內(nèi)。按實驗設(shè)計對細胞進行一定處理。
b.洗滌(選做)。對于貼壁細胞，吸除培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞1遍；對于懸浮細胞，250-1000×g室溫離心5min，吸除上清，用PBS洗滌1遍。酚紅或血清對于本試劑盒的檢測有一定的干擾。在能充分吸凈殘留液體的情況下，可以不使用PBS洗滌。
c.染色。加入適當(dāng)體積的YP1/PI檢測工作液，通常96孔板每孔加入100μl。37℃避光孵育5-20min。不同的細胞最佳孵育時間有所不同，以5min作為初始孵育時間，后續(xù)可以根據(jù)實際染色效果對染色時間進行適當(dāng)調(diào)整和優(yōu)化，以得到更加理想的染色效果。
d.檢測。孵育結(jié)束后，用熒光酶標(biāo)儀檢測(YP1染色陽性細胞為綠色熒光，Ex/Em=491/509nm；PI染色陽性細胞為紅色熒光，Ex/Em=535/617nm)。通過對比對照組兩種熒光探針的RFU (Relative fluorescence values)，可以得出凋亡細胞與壞死細胞數(shù)量的關(guān)系。​