SABC-HRP Kit (IHC, ICC, Blotting & ELISA)是基于Streptavidin-Biotin Complex (SABC)信號放大系統(tǒng)而研制的用于免疫組化(Immunohistochemistry, IHC)、免疫細(xì)胞化學(xué)(Immunocytochemistry, ICC)、Western、Northern、Southern、EMSA等印跡(blotting)檢測以及ELISA等基于生物素標(biāo)記的各種高靈敏度檢測。

本試劑盒檢測靈敏度高。與常規(guī)的檢測方法相比，由于本試劑盒采用了SABC信號放大系統(tǒng)，檢測靈敏度顯著提高，通常檢測靈敏度比常規(guī)方法可以提高約5-10倍。常規(guī)方法檢測信號過弱時(shí)，強(qiáng)烈推薦嘗試本試劑盒。
本試劑盒特異性強(qiáng)、背景低。本試劑盒采用了比Avidin特異性更強(qiáng)、背景更低、靈敏度更高的Streptavidin。Streptavidin (鏈霉親和素)是從Streptomyces adidinii 中純化獲得的一種分子量為66kD的四聚體蛋白，可以同時(shí)結(jié)合4個(gè)生物素分子，其對生物素的解離常數(shù)(Kd, dissociation constant)可達(dá)10-15M，比通�？乖�抗體的親和力高約100萬倍，可以確保與生物素高度專一地結(jié)合。Streptavidin與雞蛋清來源的Avidin (親和素)在空間結(jié)構(gòu)以及與生物素的親和力方面具有高度的相似性，但Streptavidin等電點(diǎn)幾乎為中性(pI=6.0-6.5)，其在中性條件下幾乎不帶電荷。而Avidin的pI=10.5，在中性條件下帶正電荷。因此Streptavidin比Avidin的非特異性結(jié)合更低，檢測靈敏度更高。
檢測原理：參考圖1，組織、細(xì)胞、轉(zhuǎn)移到膜上的或者結(jié)合于多孔細(xì)胞培養(yǎng)板上的抗原先與一抗結(jié)合，后者再與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合；按照適當(dāng)比例將Streptavidin和生物素標(biāo)記的辣根過氧化物酶(Biotin-labeled Horseradish Peroxidase, Biotin-HRP)混合，形成網(wǎng)絡(luò)狀的SABC-HRP (Streptavidin-Biotin Complex containing HRP)復(fù)合物；接著二抗上標(biāo)記的生物素再與SABC-HRP結(jié)合，加入HRP底物進(jìn)行顯色或發(fā)光反應(yīng)即可檢測到相應(yīng)的信號。其中Streptavidin和Biotin-HRP混合后形成網(wǎng)絡(luò)狀復(fù)合物是信號能被放大的關(guān)鍵，相當(dāng)于一個(gè)待檢測的生物素分子通過SABC-HRP復(fù)合物的識別最終可以由很多個(gè)HRP分子來顯示其信號，從而達(dá)到了信號放大的效果。

圖1. 本試劑盒的檢測原理圖。

本試劑盒用于IHC、ICC或Blotting時(shí)，可以配制成100ml的SABC工作液。按照IHC和ICC每個(gè)樣品需要使用100μl的SABC工作液計(jì)算，本試劑盒可用于1000個(gè)樣品的檢測。按照每張膜需10ml SABC工作液計(jì)算，本試劑盒可用于10次的Blotting檢測。本試劑盒用于ELISA檢測時(shí)，可以配制成500ml SABC工作液。按照ELISA檢測每個(gè)樣品需要使用100μl的SABC工作液計(jì)算，本試劑盒可用于5000個(gè)樣品的檢測。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，一年有效。4℃保存，一個(gè)月有效。
注意事項(xiàng)：
本試劑盒使用過程中所需的溶液，不能含有疊氮鈉等過氧化物酶(peroxidase)抑制劑，也不能加入可能含有生物素的溶液，如常規(guī)血清、脫脂奶粉、細(xì)胞培養(yǎng)液等，否則會降低本試劑盒的檢測靈敏度。
任何與液體孵育有關(guān)的步驟都需要確保液體能很好地覆蓋樣品。樣品沒有被液體充分覆蓋而最終出現(xiàn)發(fā)干的情況，會導(dǎo)致染色不能正常進(jìn)行。
實(shí)驗(yàn)所需緩沖液宜新鮮配制。長期放置的緩沖液可能會因?yàn)槲⑸�物污染，而�?dǎo)致檢測效果的下降。
為提高檢測靈敏度，推薦使用雙蒸水或三蒸水。低電導(dǎo)率的去離子水也可能含有微量過氧化物酶的抑制劑從而影響檢測靈敏度。
本試劑盒中的兩種試劑需配套使用，切勿與其它試劑混用。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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使用說明：
1. 參考表1配制SABC工作液
表1. SABC工作液配制表

注1：為確保充分形成Streptavidin-Biotin Complex，剛配制后必須室溫至少放置30min后才能使用。
注2：配制好的SABC工作液必須在24h內(nèi)使用完畢。
注3：SABC稀釋液：PBS, pH 7.4, 0.05% Tween-20 (除ELISA檢測外，推薦使用免疫組化染色二抗稀釋液或P0110免疫染色(非熒光)二抗稀釋液；ELISA檢測推薦使用P0110免疫染色(非熒光)二抗稀釋液)。通常宜選擇有一定封閉能力的SABC稀釋液，這樣檢測結(jié)果的背景通常會更低。
2. 免疫組化染色(IHC)
a. 需用戶自行準(zhǔn)備的試劑
(a)洗滌液(推薦使用P0106/P0106C/P0106L免疫染色洗滌液)。
(b)固定液：4%多聚甲醛(推薦使用的P0098免疫染色固定液)。
(c)封閉液(推薦使用的P0260 QuickBlock™免疫染色封閉液或P0102免疫染色封閉液)。
(d)一抗。
(e)一抗稀釋液(推薦使用的P0262 QuickBlock™免疫染色一抗稀釋液或P0103免疫染色一抗稀釋液)。
(f)二抗(推薦根據(jù)樣品的種屬特異性選購的A0279/A0288生物素高效標(biāo)記二抗，其推薦的稀釋比例均為1:100)。
(g)二抗稀釋液(推薦使用的P0267 QuickBlock™免疫組化染色二抗稀釋液或P0110免疫染色(非熒光)二抗稀釋液)。
(h)DAB顯色液(推薦使用的P0202/P0203 DAB顯色試劑盒)。
b. 染色方法
(a)按照常規(guī)方法制備石蠟或冰凍切片并滅活內(nèi)源性過氧化物酶(推薦使用的P0100A內(nèi)源性過氧化物酶封閉液或P0100B內(nèi)源性過氧化物酶強(qiáng)力封閉液)。
(b)抗原的修復(fù)：根據(jù)不同的抗原和切片的種類，選擇把切片放置在適當(dāng)?shù)目乖�修�?fù)液中進(jìn)行抗原修復(fù)(推薦使用的P0081/P0083/P0085/P0086/P0088/P0090/P0092相關(guān)抗原修復(fù)液)。
(c)洗滌液洗滌組織切片5min×4次。
(d)滴加封閉液封閉組織切片10-60min。使用P0260 QuickBlock™免疫染色封閉液僅需封閉10min，普通封閉液封閉60min。
(e)滴加一抗工作液，室溫緩慢搖動孵育1h或靜止孵育1-2h (為改善染色效果，可以4℃孵育過夜)。
(f)洗滌液洗滌組織切片5min×4次。
(g)滴加生物素標(biāo)記二抗工作液，室溫緩慢搖動孵育30-60min或靜止孵育1-2h。孵育期間，參考表1配制SABC工作液，配制后應(yīng)室溫至少放置30min后才可以使用。
(h)用洗滌液洗滌組織切片5min×4次。
(i)滴加100μl的SABC工作液，室溫緩慢搖動孵育30min或靜止孵育1h。
(j)洗滌液洗滌組織切片5min×4次。
(k)滴加約100μl DAB顯色工作液，確保能充分覆蓋樣品。室溫(約25℃)避光孵育約3-15min，至顯色達(dá)到預(yù)期效果即可去除DAB顯色工作液，用蒸餾水洗滌1-2次以終止顯色反應(yīng)。
3. 免疫細(xì)胞化學(xué)染色(ICC)
a. 需用戶自行準(zhǔn)備的試劑
(a)洗滌液(推薦使用的P0106/P0106C/P0106L免疫染色洗滌液)。
(b)固定液：4%多聚甲醛(推薦使用的P0098免疫染色固定液)。
(c)封閉液(推薦使用的P0260 QuickBlock™免疫染色封閉液或P0102免疫染色封閉液)。
(d)一抗。
(e)一抗稀釋液(推薦使用的P0262 QuickBlock™免疫染色一抗稀釋液或P0103免疫染色一抗稀釋液)。
(f)二抗(推薦根據(jù)樣品的種屬特異性選購的A0279/A0288生物素高效標(biāo)記二抗，其推薦的稀釋比例均為1:100)。
(g)二抗稀釋液(推薦使用的P0267 QuickBlock™免疫組化染色二抗稀釋液或P0110免疫染色(非熒光)二抗稀釋液)。
(h)DAB顯色液(推薦使用的P0202/P0203 DAB顯色試劑盒)。
b. 染色方法(以6孔板為例)
(a)細(xì)胞固定：去除培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞1次。每孔加入1ml固定液。固定10min后去除固定液，用洗滌液洗滌3次。
(b)細(xì)胞打孔：如果上一步的洗滌使用的是的P0106 免疫染色洗滌液等或其它含有0.1% Triton X-100的洗滌液可以忽略本步驟。否則每孔加入1ml含0.1%的Triton X-100的適當(dāng)洗滌液，室溫靜置5min后去除洗滌液。
(c)內(nèi)源性過氧化物酶的滅活：按常規(guī)方法滅活內(nèi)源性過氧化物酶(推薦使用的P0100A內(nèi)源性過氧化物酶封閉液或P0100B內(nèi)源性過氧化物酶強(qiáng)力封閉液)。
(d)加入1ml封閉液，室溫封閉10-60min。使用P0260 QuickBlock™免疫染色封閉液僅需封閉10min，普通封閉液封閉60min。
(e)去除封閉液，每孔加入0.5-1ml一抗工作液，室溫緩慢搖動孵育1h或靜止孵育1-2h (為改善染色效果，可以4℃孵育過夜)。
(f)每孔加入1ml洗滌液，室溫緩慢搖動或靜止放置洗滌5min×4次。
(g)吸盡洗滌液，每孔加入0.5-1ml生物素標(biāo)記二抗工作液，室溫緩慢搖動孵育30-60min或靜止孵育1-2h。孵育期間，參考表1配制SABC工作液，配制后應(yīng)室溫至少放置30min后才可以使用。
(h)每孔加入1ml洗滌液，室溫緩慢搖動或室溫靜止放置洗滌5min×4次。
(i)每孔加入500μl SABC工作液，室溫孵育30min。
(j)每孔加入1ml洗滌液，室溫緩慢搖動或室溫靜止放置洗滌5min×4次。
(k)每孔加入500μl DAB工作液，室溫(約25℃)避光孵育約3-15min，至顯色達(dá)到預(yù)期效果即可去除DAB顯色工作液，用蒸餾水洗滌1-2次以終止顯色反應(yīng)。顯色期間，可以在顯微鏡下觀察顯色情況，以確定繼續(xù)顯色還是終止顯色反應(yīng)。

圖2. Hela細(xì)胞Tubulin免疫染色效果圖。A. 陰性對照組(不加一抗)。B. SABC-HRP實(shí)驗(yàn)組。C. HRP標(biāo)記二抗對照組。

4. Western Blot
a. 需用戶自行準(zhǔn)備的試劑
(a)封閉液(推薦使用的P0252 QuickBlock™ Western封閉液或P0023B Western封閉液)。
(b)洗滌液(推薦使用的P0023C/P0023C3/P0023C6 Western洗滌液)。
(c)一抗。
(d)一抗稀釋液(推薦使用的P0256 QuickBlock™ Western一抗稀釋液或P0023A Western一抗稀釋液)。
(e)二抗(推薦根據(jù)樣品的種屬特異性選購的A0279/A0288生物素高效標(biāo)記二抗，其推薦的稀釋比例均為1:100)。
(f)二抗稀釋液(推薦使用的P0258 QuickBlock™ Western二抗稀釋液或P0023D Western二抗稀釋液)。
(g)DAB顯色液(推薦使用的P0202/P0203 DAB顯色試劑盒)。
b. 檢測方法
(a)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后，用封閉液室溫緩慢搖動封閉10-60min。使用P0252 QuickBlock™ Western封閉液僅需封閉10min，普通封閉液封閉60min。
(b)將膜置于一抗工作液中，室溫緩慢搖動孵育1h (為提高檢測敏感度，可以考慮4℃緩慢搖動孵育過夜)。
(c)洗滌液洗滌5min×4次。
(d)將膜置于生物素標(biāo)記二抗工作液中，室溫緩慢搖動孵育1h。孵育期間，參考表1配制SABC工作液，配制后應(yīng)室溫至少放置30min后才可以使用。
(e)洗滌液洗滌5min×4次。
(f)將膜置于SABC工作液中，室溫緩慢搖動孵育30min。
(g)洗滌液洗滌5min×4次。
(h)如果進(jìn)行DAB顯色：將膜置于適量的DAB工作液中，一般室溫避光孵育3-15min即可，去除DAB顯色工作液，用蒸餾水洗滌1-2次即可終止顯色反應(yīng)；將膜自然風(fēng)干后避光保存。DAB顯色的檢測效果參考圖3。
圖3. SABC法DAB顯色檢測效果圖。常規(guī)法采用HRP標(biāo)記二抗，SABC法采用本試劑盒。樣品為Hela細(xì)胞總蛋白，上樣量如圖中所示。一抗是AT819 Tubulin抗體，稀釋比例為1:1000。注：SABC法可以達(dá)到普通ECL發(fā)光試劑的檢測靈敏度。但除非條件所限，否則我們更推薦使用的P0018A BeyoECL Star (特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒)和HRP標(biāo)記二抗進(jìn)行Western檢測。使用BeyoECL Star檢測時(shí)的靈敏度比本試劑盒方法還要高約10倍或更多。
5. ELISA
a. 需用戶準(zhǔn)備的試劑
(a)包被緩沖液：0.2M碳酸氫鹽緩沖液，pH 9.4。
(b)洗滌液：PBS, pH7.4, 0.05% Tween-20, 0.1% BSA (推薦使用的P0106/P0106C/P0106L免疫染色洗滌液)。
(c)封閉液：PBS, 1% BSA (推薦使用的P0260 QuickBlock™免疫染色封閉液或P0102免疫染色封閉液)。
(d)抗原溶液：溶于包被緩沖液。
(e)一抗。
(f)一抗稀釋液(推薦使用的P0103免疫染色一抗稀釋液)。
(g)二抗(推薦根據(jù)樣品的種屬特異性選購的A0279/A0288生物素高效標(biāo)記二抗，其推薦的稀釋比例均為1:100)。
(h)二抗稀釋液(推薦使用的P0267 QuickBlock™免疫組化染色二抗稀釋液或P0110免疫染色(非熒光)二抗稀釋液)。
(i)酶反應(yīng)底物(推薦使用的P0209 TMB顯色液)。
b. 檢測方法(以96孔板為例)
(a)每孔中加入50-200μl的抗原溶液，室溫孵育1h或4℃過夜。
(b)去除孔中液體并在吸水紙上拍干殘余液體，每孔用200μl洗滌液洗滌3次，去除孔中的液體并在吸水紙上拍干。
(c)每孔加入200μl的封閉液室溫孵育60min。
(d)去除孔中液體并在吸水紙上拍干殘余液體，加入100μl的一抗工作液，室溫孵育30min。
(e)每孔用200μl洗滌液洗滌3次，去除孔中的液體并在吸水紙上拍干殘余液體。
(f)每孔加入100μl生物素標(biāo)記二抗工作液，室溫孵育30min (此時(shí)應(yīng)配制SABC工作液，配制方法參考表1)。
(g)每孔用200μl洗滌液洗滌3次，然后加入200μl洗滌液孵育5min。
(h)去除孔中的液體并在吸水紙上拍干，每孔加入100μl SABC工作液，室溫孵育30min。
(i)每孔用200μl洗滌液洗滌3次，然后加入200μl洗滌液孵育5min，去除孔中的液體并在吸水紙上拍干。
(j)每孔加入200μl酶反應(yīng)底物(推薦使用的P0209 TMB顯色液)，室溫避光孵育3-30min或更長時(shí)間，直至顯色至預(yù)期深淺，測定吸光度�？梢愿鶕�(jù)實(shí)驗(yàn)需要考慮加入顯色終止試劑，如使用TMB顯色，每孔可加入50μl的2M H2SO4終止反應(yīng)，加入硫酸后，溶液呈黃色，此時(shí)可以在450nm測定吸光度。

常見問題：
1.背景太深
a.考慮使用適當(dāng)?shù)姆忾]液進(jìn)行封閉，例如選擇推薦的封閉液進(jìn)行封閉。
b.內(nèi)源性蛋白結(jié)合的生物素，內(nèi)源性凝集素以及離子間的相互作用都會使背景顯色加深。針對內(nèi)源性蛋白結(jié)合的生物素可采用生物素檢測封閉液進(jìn)行封閉(推薦使用的P0101生物素檢測封閉試劑盒)；對于內(nèi)源性凝集素可在SABC稀釋液中加入0.2M的ɑ-甲基甘露糖進(jìn)行封閉；而對于離子間的相互作用帶來的干擾，可以通過把SABC試劑溶于含有0.5M NaCl的緩沖液中來消除。
c.對于免疫染色，需注意用適當(dāng)方法滅活內(nèi)源性過氧化物酶。例如嘗試的P0100B內(nèi)源性過氧化物酶強(qiáng)力封閉液。
d.考慮適當(dāng)降低一抗或二抗?jié)舛�。另外，選擇適當(dāng)強(qiáng)度的洗滌液，或適當(dāng)延長洗滌時(shí)間也會有所幫助。
2.沒有信號或信號太弱
a.評估樣品中待檢測的蛋白的表達(dá)水平是否足夠高，最好能選擇高表達(dá)的樣品作為陽性對照。
b.考慮適當(dāng)提高一抗或二抗的濃度。
c.適當(dāng)延長顯色或發(fā)光時(shí)間，另外須確定抗原修復(fù)對于所使用的一抗是否是必需或有效的。

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