谷胱甘肽還原酶檢測試劑盒(DTNB法)(Glutathione Reductase Assay Kit with DTNB)是一種簡單易行的通過比色法來檢測細(xì)胞、組織或其它樣品中谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase,GR)活性的試劑盒。谷胱甘肽還原酶在許多組織中都有分布，可以維持細(xì)胞內(nèi)充足的還原型谷胱甘肽(GSH)水平。GSH可以清除自由基和一些有機(jī)過氧化物，或作為谷胱甘肽氧化酶(Glutathione peroxidase)的底物來清除一些過氧化物。

谷胱甘肽還原酶可以還原氧化型谷胱甘肽(GSSG)生成還原型谷胱甘肽(GSH)，而GSH可以和生色底物DTNB反應(yīng)產(chǎn)生黃色的TNB和GSSG，并可以通過測定A412來檢測TNB的生成量。適當(dāng)設(shè)置應(yīng)體系，前后兩個反應(yīng)合并起來后，GSSG/GSH過量而GR相對不足時，該反應(yīng)體系中谷胱甘肽還原酶就成為整個反應(yīng)體系的限速因素，此時黃色的TNB生成量和谷胱甘肽還原酶的活性呈線性正相關(guān)。從而通過測定A412就可以計算出谷胱甘肽還原酶的活性水平。本試劑盒的具體反應(yīng)原理如下：

兩個反應(yīng)相合并：
本試劑盒檢測肝臟樣品的檢測效果如圖1所示。圖中可見，對于肝臟樣品可以檢測到比較強(qiáng)的谷胱甘肽還原酶的活性并且有很好的劑量效應(yīng)。
圖1. 谷胱甘肽還原酶檢測試劑盒(DTNB法)用于肝臟裂解樣品的實(shí)測效果圖。包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，一年有效。NADPH溶解后宜分裝并-70℃保存，4℃可以保存一天，-20℃保存一周后NADPH會降解10%以上。GSSG和DTNB在配制成溶液后，適當(dāng)分裝后-20℃保存。
注意事項(xiàng)：
本試劑盒檢測時涉及氧化還原反應(yīng)，因此所有氧化劑或還原劑都會干擾本試劑盒的測定。如果在樣品中的還原劑無法避免，例如DTT、巰基乙醇等，則這些還原劑的總濃度至少低于0.1mM。0.15mM的DTT可以抑制40%的酶活力。另外，硫酸鈉、硫酸銨和鐵氰化物都會干擾本試劑盒的測定。請盡量避免。
樣品可以立即測定，也可以-70℃凍存待以后測定。
一定要嚴(yán)格控制反應(yīng)時的溫度為25℃，否則會引起較多誤差。
NADPH不太穩(wěn)定，要嚴(yán)格按照后續(xù)說明操作，謹(jǐn)防失活。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。 

使用說明：
1.樣品的準(zhǔn)備：
a.細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備。對于貼壁細(xì)胞，由于后續(xù)用于酶活性的測定，應(yīng)避免使用胰酶消化細(xì)胞，可以用PBS、HBSS或生理鹽水洗滌一遍。對于懸浮細(xì)胞，可以離心收集細(xì)胞，并用PBS、HBSS或生理鹽水洗滌一遍。后續(xù)可以用Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013)參考相應(yīng)的說明裂解細(xì)胞樣品。按照每100萬細(xì)胞直接加入100-200微升裂解液的比例進(jìn)行裂解。對于貼壁細(xì)胞，可以使用細(xì)胞鏟或細(xì)胞刮(FLFT021/FSCP023/FSCP029)輔助收集細(xì)胞樣品。如果出現(xiàn)裂解效果不佳的情況，可以把處在裂解液中的細(xì)胞樣品用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿。隨后4℃，12,000×g離心10分鐘。取上清用于酶活性的測定。
b.組織樣品的準(zhǔn)備。動物用含有0.16mg/ml heparin的生理鹽水(0.9% NaCl containing 0.16mg/ml heparin)灌流清除血液后獲取組織樣品。按照約每20mg組織加入200微升Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013)或其它適當(dāng)?shù)膭驖{液的比例，用TissueMaster™手持式組織研磨儀(E6600)或玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿。4℃，12,000×g離心10分鐘。取上清用于酶活性的測定。
c.紅細(xì)胞裂解液的準(zhǔn)備。用抗凝管收集血液，顛倒混勻。取至少500微升全血4℃ 2500×g離心5分鐘。棄上清，用冰冷的約紅細(xì)胞沉淀10倍體積的Western及IP細(xì)胞裂解液(P0013)或其它適當(dāng)?shù)膭驖{液重懸沉淀，再同前離心，棄上清。加入約紅細(xì)胞沉淀4倍體積的冰冷的Milli-Q級純水裂解紅細(xì)胞。12,000×g離心5分鐘，取上清。
d.上述各種樣品可以用BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)測定蛋白濃度。通常可以先取含1-100微克蛋白的樣品用于谷胱甘肽還原酶的檢測。注：對于GR活力較高的組織樣品，含1-10微克蛋白的樣品可能就能滿足檢測需求，而對于GR活力較低的樣品，可能需要10-100微克的蛋白量。如果發(fā)現(xiàn)樣品中谷胱甘肽還原酶的活力過高，可以用谷胱甘肽還原酶檢測緩沖液進(jìn)行稀釋。如果樣品中谷胱甘肽還原酶的活力過低，則需適當(dāng)加大蛋白用量。準(zhǔn)備好的樣品如果當(dāng)日測定，可以在冰浴或4℃臨時保存；如果不能當(dāng)日檢測，可以-70℃凍存。
2.試劑盒的準(zhǔn)備工作：
a.配制6mM NADPH溶液的配制。在本試劑盒提供的5mg NADPH中加入1ml Milli-Q級純水或重蒸水，溶解并混勻，即為6mM NADPH溶液。除立即待用部分外，其余的NADPH溶液需適當(dāng)分裝后盡快-70℃保存。
b.GSSG溶液的配制。在本試劑盒提供的14.2mg GSSG中加入10ml Milli-Q級純水，溶解并混勻。除立即待用部分外，其余的GSSG溶液需適當(dāng)分裝后-20℃保存。
c.DTNB溶液的配制。在本試劑盒提供的4.5mg DTNB中加入1.5毫升本試劑盒提供的DMSO，溶解并混勻。除立即待用部分外，其余的DTNB溶液需適當(dāng)分裝后-20℃保存。
d.所有試劑在使用前均須在水浴中或PCR儀等設(shè)備上溫育到25℃。
3.樣品測定：
a.參考下表(表1)，使用96孔板，依次加入各溶液，混勻。

b.加入6.6微升DTNB溶液，混勻。
c.立即使用適當(dāng)?shù)拿笜?biāo)儀或微量紫外分光光度計測定A412，此時記錄為0分鐘讀值，即A412 (Time 0)。如果儀器可以設(shè)置溫度，把溫度設(shè)置在25℃，否則可以通過空調(diào)調(diào)節(jié)室溫到25℃，待預(yù)計儀器也達(dá)到25℃后再開始測定A412。
d.每隔2分鐘記錄A412值，即A412 (Time n)，至少連續(xù)記錄10分鐘，獲得5個點(diǎn)的數(shù)據(jù)�；蛘呷绻麅x器具備相應(yīng)功能，可以讓儀器連續(xù)測定10分鐘或自動每隔2分鐘測定一次A412。如果樣品的吸光度比較低，可以延長孵育時間，樣品的吸光度在一定范圍內(nèi)會隨時間的延長接近于線性增加的，此時可以考慮每10分鐘測定一次吸光度。
4.樣品中谷胱甘肽還原酶酶活力的計算：
a.谷胱甘肽還原酶酶活力單位的定義：1個酶活力單位(1 unit)在25℃，pH7.5的條件下，在1分鐘內(nèi)可以還原化1微摩爾GSSG。1 U=1000 mU。
b.計算時每個樣品的A412/min都需要扣除相應(yīng)的樣品本底對照測定出來的A412/min。測定出來的ΔA412/min最好能控制在0.005-0.1范圍內(nèi)。如測定出來的ΔA412/min數(shù)值過大，則可以把樣品適當(dāng)稀釋或者減小樣品的用量，如ΔA412/min數(shù)值過小，處理樣品時需設(shè)法盡量濃縮樣品、并適當(dāng)加大樣品的用量。肝臟裂解樣品的實(shí)測效果參考圖1。
注：ΔA412 (blank)=A412 (blank, Time n)-A412 (blank, Time 0);
ΔA412 (sample)=A412 (sample, Time n)-A412 (sample, Time 0);
ΔA412=ΔA412 (sample)-ΔA412 (blank);
ΔA412/min=ΔA412/n
c.對于谷胱甘肽還原酶：1mU/ml＝1nmol TNB/min/ml＝(ΔA412/min)/(εμM×L(cm))
即相當(dāng)于：[檢測體系中谷胱甘肽還原酶活力]= (ΔA412/min)/(εμM×L(cm))=[(ΔA412 (sample)-ΔA412 (blank))/min]/ (εμM×L(cm))
[樣品中谷胱甘肽還原酶活力]＝[檢測體系中消耗谷胱甘肽還原酶活力]×[稀釋倍數(shù)]/[樣品中的蛋白濃度] = [(ΔA412/min)/(εμM×L(cm))]×[dil×(V(ml)/Vsample(ml))]/[樣品中的蛋白濃度]
注：[檢測體系中谷胱甘肽還原酶活力]的單位為mU/ml，[樣品中的蛋白濃度]的單位為mg/ml，所以最終[樣品中谷胱甘肽還原酶活力]的單位為：U/mg蛋白或mU/mg蛋白；
εμM為摩爾消光系數(shù)：TNB在A412的摩爾消光系數(shù)為0.01415μM-1cm-1；
L(cm)為測吸光度時的路徑長度：200μl樣品在一般的96孔中的高度約為0.552cm，如果使用不同的反應(yīng)孔，請注意修改為溶液在該孔中的高度；
dil為樣品的稀釋倍數(shù)；
V(ml)為反應(yīng)體系，本反應(yīng)體系為0.2ml；
Vsample(ml)為反應(yīng)體系中樣品的體積，以毫升表示。
d.計算示例：樣品的蛋白濃度經(jīng)測定為5mg/ml，用樣品稀釋液稀釋10倍后，取10微升稀釋后的樣品參考表1進(jìn)行測定。如果ΔA412/min(sample)＝0.048，ΔA412/min(blank)＝0.006，那么：
[檢測體系中谷胱甘肽還原酶活力]= (0.048-0.006)/(0.01415×0.552) =5.38mU/ml
[樣品中谷胱甘肽還原酶活力]= 5.38mU/ml×10×0.2/0.01/(5mg/ml)= 0.2152U/mg(蛋白)