G6PDH活性檢測(cè)試劑盒(WST-8法) (G6PDH Activity Assay Kit with WST-8)是一種高靈敏度的基于WST-8的顯色反應(yīng)，通過(guò)比色法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞、組織或其它樣品中G6PDH (glucose-6-phosphate dehydrogenase)酶活性的檢測(cè)試劑盒。

WST-8是MTT的一種升級(jí)替代產(chǎn)品，和MTT或其他MTT類似產(chǎn)品如XTT、MTS等相比有明顯的優(yōu)點(diǎn)。首先，MTT被一些脫氫酶還原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液來(lái)溶解；而WST-8和XTT、MTS產(chǎn)生的formazan都是水溶性的，可以省去后續(xù)的溶解步驟。其次，WST-8產(chǎn)生的formazan比XTT和MTS產(chǎn)生的formazan更易溶解。再次，WST-8比XTT和MTS更加穩(wěn)定，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加穩(wěn)定。另外，WST-8和MTT、XTT等相比，線性范圍更寬，靈敏度更高。WST-8和WST-1相比，檢測(cè)靈敏度更高，更易溶解，并且更加穩(wěn)定。
本試劑盒使用便捷。使用細(xì)胞、組織等的裂解液即可進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)需分離純化細(xì)胞、組織或其它樣品中的G6PDH。
本試劑盒檢測(cè)靈敏度高，線性范圍寬。可以每孔含量低至0.05mU的G6PDH，在1mU/ml (0.05mU/孔)至100mU/ml (5mU/孔)之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，簡(jiǎn)稱G6PDH或G6PD)可催化葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate，G6P)轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)脂(6-phosphogluconate, 6-PG)，這是磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway, PPP)的第一個(gè)步驟，也是該途徑的限速步驟。磷酸戊糖途徑對(duì)于NADPH (還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，也稱為還原型輔酶II)和戊糖的生成至關(guān)重要。NADPH對(duì)于通過(guò)GSH的再生來(lái)調(diào)控氧化還原平衡以及脂肪酸生物合成來(lái)說(shuō)都至關(guān)重要。所以G6PDH的缺乏會(huì)導(dǎo)致由于不能生成NADPH而引起的一些疾病，如新生兒黃疸、非免疫性溶血性貧血等。
本試劑盒可檢測(cè)樣品中的G6PDH的酶活性，具體原理如下：G6P在G6PDH的作用下氧化生成6-PG，在這一反應(yīng)過(guò)程中NADP+被還原為NADPH，生成的NADPH在電子耦合試劑1-mPMS (1-Methoxy-5-methylphenazinium Methyl Sulfate)的作用下將WST-8還原生成橙黃色的formazan，在450nm左右有最大吸收峰。反應(yīng)體系中生成的formazan與樣品中G6PDH的活性呈正比關(guān)系。WST-8法檢測(cè)G6PDH的原理參考圖1。

圖1.WST-8法檢測(cè)G6PDH酶活性的原理圖。

本試劑盒適用于檢測(cè)細(xì)胞、組織以及其它適當(dāng)樣品(如血液、血清)中的G6PDH活性。
本試劑盒可以測(cè)定100個(gè)樣品。

包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，一年有效。顯色液(S0189-3)須-20℃避光保存。
注意事項(xiàng)：
經(jīng)檢測(cè)本試劑盒中的G6PDH (細(xì)菌來(lái)源)室溫存放72小時(shí)或反復(fù)凍融5次不影響其酶活性。但對(duì)于不同物種的G6PDH是否能耐受長(zhǎng)時(shí)間的室溫存放或反復(fù)凍融須自行測(cè)試，初次檢測(cè)時(shí)盡量使用新鮮制備的樣品。
由于G6PDH提取液本身略顯粘稠，以該提取液作為稀釋液時(shí)，無(wú)論對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品還是樣品進(jìn)行稀釋，在稀釋過(guò)程中務(wù)必確保稀釋均勻，否則易造成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)產(chǎn)生較大波動(dòng)。
在樣品加樣和混勻過(guò)程中，須盡量避免產(chǎn)生氣泡，以免影響最終的吸光度測(cè)定。
如果需要測(cè)定樣品中G6PDH的絕對(duì)活力而又不能非常嚴(yán)格地控制反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間，則每次檢測(cè)都需要設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線。
如果樣品溶液中G6PDH活性過(guò)高或過(guò)低，不在試劑盒的線性檢測(cè)范圍內(nèi)時(shí)，可適當(dāng)調(diào)整樣品或者提取液的用量。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說(shuō)明：
1. 樣品的準(zhǔn)備：
a. G6PDH提取液室溫或37℃水浴解凍，解凍后置于冰浴。如果37℃水浴解凍，須注意解凍后立即置于冰浴。
b. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：對(duì)于貼壁細(xì)胞，約1×106個(gè)細(xì)胞(大約相當(dāng)于6孔板一個(gè)孔長(zhǎng)滿的細(xì)胞數(shù)量)，吸凈培養(yǎng)液，用移液器加入200μl的冰浴預(yù)冷的G6PDH提取液，并輕輕吹打，以促進(jìn)細(xì)胞的裂解；對(duì)于懸浮細(xì)胞，收集約1×106個(gè)細(xì)胞，600g離心5分鐘，吸凈培養(yǎng)液，用移液器加入200μl冰浴預(yù)冷的G6PDH提取液，并輕輕吹打，以促進(jìn)細(xì)胞的裂解。隨后12,000g，4℃離心5-10分鐘，取上清作為待測(cè)樣品，冰浴存放備用。注：裂解過(guò)程在冰上或室溫操作均可，但以冰浴操作為佳，可以有效減少內(nèi)源性蛋白酶等導(dǎo)致的酶活性下降。
c. 組織樣品的準(zhǔn)備：冰浴預(yù)冷的PBS洗滌組織后，稱取約10-30mg的組織樣品，用剪刀剪碎，置于勻漿器中，加入400μl的冰浴預(yù)冷的G6PDH提取液在冰上或室溫進(jìn)行勻漿。隨后12,000g，4℃離心5-10分鐘，取上清作為待測(cè)樣品，冰浴存放備用。注：勻漿過(guò)程在冰上或室溫操作均可，但以冰浴操作為佳，可以有效減少內(nèi)源性蛋白酶等導(dǎo)致的酶活性下降。
2. 試劑盒的準(zhǔn)備工作：
a. G6PDH標(biāo)準(zhǔn)品的配制：取4μl G6PDH (0.25U/μl，即250U/ml)和996μl G6PDH提取液混勻即為1U/ml G6PDH標(biāo)準(zhǔn)品。注意：稀釋后的G6PDH不太穩(wěn)定，配制后宜盡快使用。
b. G6PDH標(biāo)準(zhǔn)曲線的設(shè)置：取200μl G6PDH標(biāo)準(zhǔn)品(1U/ml)用G6PDH提取液3倍系列稀釋(serial dilution)成適當(dāng)?shù)臐舛忍荻龋�如初次檢測(cè)可以設(shè)置0、1.37、4.1、12.3、37、111、333、1000mU/ml這幾個(gè)濃度，檢測(cè)時(shí)96孔板每孔加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品，相當(dāng)于每孔加入的G6PDH的酶量為0、0.069、0.21、0.62、1.85、5.56、16.7、50mU。如有必要，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中可以根據(jù)樣品中的G6PDH活性對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度范圍進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。其中濃度為0mU/ml的標(biāo)準(zhǔn)品為空白對(duì)照 (Blank)，僅含G6PDH提取液。
c. G6PDH檢測(cè)液的配制：樣品中的NADPH等可能會(huì)產(chǎn)生一定的背景，建議設(shè)置加入樣品而不加入G6PDH底物的背景對(duì)照；對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的G6PDH檢測(cè)液，需要加入G6PDH底物。每個(gè)背景對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的檢測(cè)需要使用50μl的G6PDH檢測(cè)液，請(qǐng)根據(jù)所需檢測(cè)的背景對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的數(shù)量，配制適量的G6PDH檢測(cè)液，并注意現(xiàn)配現(xiàn)用。G6PDH檢測(cè)液的配制方法如下：

3. 樣品測(cè)定：
a. 樣品G6PDH活性的測(cè)定：吸取50μl待測(cè)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品至96孔板中，為了減少實(shí)驗(yàn)誤差建議設(shè)置樣品的重復(fù)孔。后續(xù)如果發(fā)現(xiàn)樣品中的G6PDH活性過(guò)高，超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品的線性檢測(cè)范圍，則需要用G6PDH提取液將樣品適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行檢測(cè)；活性過(guò)低時(shí)則需要加大細(xì)胞或組織樣品的用量。
b. 每孔加入50μl G6PDH檢測(cè)液到樣品或標(biāo)準(zhǔn)品孔，適當(dāng)混勻。背景對(duì)照孔需要加入50μl不含G6PDH底物的G6PDH檢測(cè)液。在加入G6PDH檢測(cè)液的過(guò)程中須輕柔操作，以免產(chǎn)生氣泡。若不慎出現(xiàn)氣泡，可使用細(xì)小的吸頭或針頭戳破。特別注意：如果樣品中的NADPH等產(chǎn)生的背景比較高，就必須設(shè)置背景對(duì)照；初次檢測(cè)宜設(shè)置背景對(duì)照。
c. 37℃避光孵育10分鐘，此時(shí)會(huì)形成橙黃色的formazan。測(cè)量450nm處的吸光度，如果顯色較淺，也可以適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間至15-30分鐘，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)顯色會(huì)越來(lái)越深。
4. 樣品中G6PDH活性的計(jì)算：
a. 將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的吸光度減去標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0mU/ml的空白對(duì)照(Blank)吸光度。同時(shí)，如果背景對(duì)照(Background)的吸光度比較高，需要再將所有樣品的吸光度減去各自的背景對(duì)照的吸光度。
b. 以G6PDH酶活性為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。G6PDH標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)效果請(qǐng)參考圖2。

圖2. 本試劑盒檢測(cè)G6PDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖中G6PDH的濃度分別0、1.37、4.1、12.3、37、111mU/ml，反應(yīng)時(shí)間為30分鐘。如果適當(dāng)縮短反應(yīng)時(shí)間，可以在0-1000mU/ml的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。不同的檢測(cè)條件下，實(shí)際讀數(shù)會(huì)因標(biāo)準(zhǔn)品的配制、檢測(cè)儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

c. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞、組織等樣品中的G6PDH活性。
備注：根據(jù)檢測(cè)得到的活性及樣品的體積，即可計(jì)算出G6PDH的活力單位。
d. 如果希望更加精確地來(lái)表述G6PDH的酶活力，可以將G6PDH提取液制備的細(xì)胞或組織樣品用BCA法測(cè)定蛋白濃度。最終用單位蛋白量中G6PDH的活力單位來(lái)比較精確地進(jìn)行表述。

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