中性紅細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(Neutral Red Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit)是一種基于細(xì)胞對(duì)于中性紅的攝入能力來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖或細(xì)胞毒性的試劑盒。
細(xì)胞對(duì)中性紅的攝入取決于細(xì)胞對(duì)pH梯度的維持能力，而這種能力是通過(guò)產(chǎn)生ATP來(lái)維持的。在生理pH條件下，中性紅染料的凈電荷幾乎為零，從而使其能通過(guò)非離子被動(dòng)擴(kuò)散的方式穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。溶酶體(lysosomes)中的質(zhì)子梯度使溶酶體中的pH值低于細(xì)胞質(zhì)，從而可以使中性紅帶上電荷并在溶酶體中積累。在細(xì)胞增殖加快時(shí)，細(xì)胞數(shù)量增多，可以攝入的中性紅的量就會(huì)增加。在細(xì)胞受到損傷時(shí)，中性紅的攝入能力會(huì)下降。經(jīng)過(guò)一定時(shí)間攝入后，細(xì)胞經(jīng)清洗并用裂解液裂解即可釋放中性紅而用于檢測(cè)。這樣通過(guò)測(cè)定細(xì)胞對(duì)于中性紅的攝入量，就可以確定細(xì)胞的增殖或毒性情況。
中性紅同時(shí)也是一種pH指示劑，在酸性時(shí)呈紅色，在pH6.8升至pH8.0時(shí)由紅色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。對(duì)于活細(xì)胞，中性紅積累在溶酶體中，而溶酶體中是酸性環(huán)境，因此溶酶體被中性紅染成紅色。本產(chǎn)品中的中性紅染色液對(duì)正常培養(yǎng)的L929細(xì)胞的染色效果參考圖1。
圖1. 正常培養(yǎng)的L929細(xì)胞加入中性紅染色液后的染色效果。
中性紅的分子式為C15H17CIN4，分子量為288.8，CAS Number為553-24-2。
本試劑盒可以用于檢測(cè)500個(gè)樣品。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| C0013-1 | 中性紅染色液 | 10ml |
| C0013-2 | 中性紅檢測(cè)裂解液 | 100ml |
| — | 說(shuō)明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃保存，一年有效。中性紅染色液需避光保存。
注意事項(xiàng)：
需準(zhǔn)備一臺(tái)可以測(cè)定A540的酶標(biāo)儀或微量分光光度計(jì)。
第一次使用本試劑盒時(shí)建議先取少量樣品做好預(yù)實(shí)驗(yàn)。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說(shuō)明：
1. 把細(xì)胞培養(yǎng)在96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入200微升細(xì)胞培養(yǎng)液，設(shè)置適當(dāng)?shù)年幮詫?duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，并給予藥物刺激。
2. 至待檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，如果培養(yǎng)液中的藥物推測(cè)不會(huì)對(duì)后續(xù)檢測(cè)產(chǎn)生干擾，直接加入20微升中性紅染色液；如果培養(yǎng)液中的藥物可能會(huì)對(duì)后續(xù)檢測(cè)產(chǎn)生干擾，先用PBS、DPBS或HBSS等適當(dāng)溶液洗滌1-2次，隨后加入200微升細(xì)胞培養(yǎng)液，并加入20微升中性紅染色液。
3. 細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2小時(shí)。注：對(duì)于細(xì)胞密度非常低，細(xì)胞代謝速率非常慢的情況，可以把孵育時(shí)間延長(zhǎng)到3-4個(gè)小時(shí)。
4. 去除含有中性紅染色液的細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS、DPBS或HBSS等適當(dāng)溶液洗滌1-2次。
5. 加入200微升中性紅檢測(cè)裂解液，室溫?fù)u床上裂解10分鐘。在搖床上搖動(dòng)可以促進(jìn)樣品的裂解。
6. 測(cè)定樣品的A540，可以選擇690nm作為參考波長(zhǎng)。
圖2. 本產(chǎn)品對(duì)L929細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)的效果圖。實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)會(huì)因細(xì)胞種類、細(xì)胞狀態(tài)、檢測(cè)儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。
常見問(wèn)題：
1. 中性紅染色液長(zhǎng)期存放會(huì)產(chǎn)生沉淀�？梢灾苯游∪旧旱纳锨逡菏褂�，也可以使用針頭濾器等過(guò)濾去除沉淀后繼續(xù)使用，不會(huì)影響使用效果。因?yàn)槿旧褐械闹行约t本來(lái)就是過(guò)量的。
2. 96孔板在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)存在蒸發(fā)問(wèn)題。在加入中性紅染色液前，如果培養(yǎng)液存在明顯的蒸發(fā)問(wèn)題，會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，并嚴(yán)重影響后續(xù)的檢測(cè)結(jié)果。
