細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒(Senescence β-Galactosidase Staining Kit)是一種基于衰老時衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase; SA-β-Gal)活性水平上調(diào)而對衰老細(xì)胞或組織進(jìn)行染色檢測的試劑盒。在普通的光學(xué)顯微鏡下就可以觀測到細(xì)胞或組織的衰老情況。本試劑盒可以用于培養(yǎng)細(xì)胞的衰老檢測，也可以用于組織切片的衰老檢測。

絕大多數(shù)正常細(xì)胞被認(rèn)為僅有有限的分裂能力，在不能分裂后就進(jìn)入衰老(senescence)狀態(tài)。此時細(xì)胞仍然是存活的，但細(xì)胞的基因和蛋白的表達(dá)譜發(fā)生了很大改變。衰老的細(xì)胞不能在一些常規(guī)的刺激下再誘導(dǎo)細(xì)胞分裂，并且衰老細(xì)胞的細(xì)胞周期分布也比較特殊，不同于一些損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞休眠，也不同于細(xì)胞生長接觸抑制的情況。衰老細(xì)胞通常體積變大，并表達(dá)在pH6.0時有高酶活性的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)。細(xì)胞衰老也被認(rèn)為是生物體抑制腫瘤的一種方式，同時也是生物體老化(aging)的一種潛在原因。
細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒，以X-Gal為底物，在衰老特異性的β-半乳糖苷酶催化下會生成深藍(lán)色產(chǎn)物。從而在光學(xué)顯微鏡下很容易觀察到變成藍(lán)色的表達(dá)β-半乳糖苷酶的細(xì)胞或組織。本產(chǎn)品染色的染色效果請參考圖1。

圖1. 細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒用于MCF-7細(xì)胞的染色效果圖。圖A是正常的MCF-7細(xì)胞，圖B是MCF-7細(xì)胞用Etoposide (SC0173)處理誘導(dǎo)的衰老組。實際染色效果會因樣品及實驗條件的不同而存在差異，本圖僅供參考。
本試劑盒僅染色衰老細(xì)胞，不會染色衰老前的細(xì)胞(presenescent cells)、靜止期細(xì)胞(quiescent cells)、永生細(xì)胞(immortal cells)或腫瘤細(xì)胞。
主要特點：本試劑盒經(jīng)過多方面的優(yōu)化，是同類產(chǎn)品中首創(chuàng)的能兼容普通的細(xì)胞培養(yǎng)用多孔板、移液管等聚苯乙烯類材質(zhì)耗材或容器的試劑盒。本試劑盒可以有效避免由于和多孔板、移液管等的不兼容導(dǎo)致的染色偏弱、染色效果不穩(wěn)定等情況。通常同類試劑盒要求使用可高溫高壓滅菌的聚丙烯(polypropylene)材質(zhì)的耗材、容器或玻璃容器進(jìn)行溶液的配制，而不能使用普通的多孔板、移液管等聚苯乙烯(polystyrene)類材質(zhì)的容器或耗材，否則可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，影響實驗觀察。即使嚴(yán)格按照要求操作，也會在染色時間比較長的情況下，容易出現(xiàn)絮狀物沉淀(參考圖2)。本試劑盒經(jīng)過多方面的優(yōu)化，對耗材或容器的材質(zhì)無特殊要求，可以兼容普通的多孔板和移液管等常用耗材和容器。而且配制的工作液不會產(chǎn)生沉淀或不溶物，使用更加便捷。

圖2. 本試劑盒優(yōu)化前后的對比圖。優(yōu)化前，X-Gal溶液直接接觸聚苯乙烯類材質(zhì)的材料如移液管、多孔板等會產(chǎn)生明顯的腐蝕(A圖)，使用聚苯乙烯容器配制染色工作液后，在顯微鏡下觀察有異常的絮狀不溶物(C圖)；優(yōu)化后，X-Gal溶液直接接觸聚苯乙烯類材質(zhì)的材料觀察不到有任何異常情況(B圖)，使用聚苯乙烯容器配制染色工作液后，在顯微鏡下觀察也沒有任何異常情況(D圖)。

如果使用6孔板檢測，足夠測定100個樣品；使用24孔板測定，足夠測定400個樣品；使用96孔板測定，足夠測定1000個樣品。對于組織切片或組織塊，可以檢測的樣品數(shù)量視樣品的大小而定。對于普通切片的滴染足夠檢測100個樣品。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，一年有效。其中X-Gal溶液需避光保存。
注意事項：
β-半乳糖苷酶染色固定液對人體有毒、有腐蝕性，操作時請?zhí)貏e小心，并注意有效防護(hù)以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。
X-Gal溶液在-20℃或4℃保存會凍結(jié)，室溫或37℃水浴2-5分鐘并適當(dāng)搖動即可完全融解。
細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色反應(yīng)依賴于特定的pH條件，不能在二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行染色反應(yīng)。用于細(xì)胞培養(yǎng)的二氧化碳培養(yǎng)箱中較高濃度的二氧化碳會影響染色工作液的pH值，而導(dǎo)致染色失敗。
試劑解凍后或使用前如果有沉淀，必須在使用前確保沉淀全部溶解。β-半乳糖苷酶染色液B剛從試劑盒中取出時，管底可能存在少量沉淀，屬正常現(xiàn)象，充分混勻或Vortex后，沉淀會全部溶解，并須確保在全部溶解后使用。配制染色工作液時，也可能有少量絮狀沉淀出現(xiàn)，震蕩混勻后就會完全溶解，且須確保全部溶解后才能使用。
使用96孔板等多孔板進(jìn)行檢測時，如果孵育過夜容易產(chǎn)生所謂的“邊緣效應(yīng)”(edge effect)，即多孔板四周的孔由于和外界最直接接觸，易受外界環(huán)境影響，其中最明顯的是四周細(xì)胞培養(yǎng)孔的蒸發(fā)效應(yīng)。邊緣效應(yīng)會導(dǎo)致細(xì)胞生長不均勻、細(xì)胞分布不均一、培養(yǎng)液體積不一致、培養(yǎng)液中相關(guān)成分的濃度、pH值不一致。建議采取以下方法避免96孔板等多孔板的邊緣效應(yīng)：避免孵育過長時間，以避免蒸發(fā)等帶來的邊緣效應(yīng)；棄用邊緣孔并在棄用的邊緣孔中加入等量的水、PBS或其他適當(dāng)溶液；在多孔板非孔的凹陷處加入適量的水或其他適當(dāng)溶液；將整塊板放在濕盒中；使用防揮發(fā)蓋；在實驗設(shè)計時，實驗樣品最好進(jìn)行隨機(jī)分配，不要將某一組樣品固定放在某個位置而引入可能的系統(tǒng)性誤差。
需自備PBS或HBSS(Hanks Balanced Salt Solution)。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。  

使用說明：
1. 對于貼壁細(xì)胞：
a. 對于6孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS或HBSS洗滌1次，加入1毫升β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15分鐘。對于其它類型的培養(yǎng)板，固定液及后續(xù)溶液的用量參照此比例進(jìn)行操作。
b. 吸除細(xì)胞固定液，用PBS或HBSS洗滌細(xì)胞3次，每次3分鐘。
c. 吸除PBS或HBSS，每孔加入1毫升染色工作液。染色工作液的配制方法參考表1。

d. 37℃孵育過夜，可以用parafilm或保鮮膜封住6孔板防止蒸發(fā)。注意：37℃孵育不能在二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行。
e. 普通光學(xué)顯微鏡下觀察。如不能及時觀察計數(shù)，可以去除染色工作液，加入2毫升PBS，4℃可以保存數(shù)天；或者加上封片液封片后，4℃可以保存較長時間。
2. 對于懸浮細(xì)胞：
a. 離心收集細(xì)胞至1.5ml離心管內(nèi)，用PBS或HBSS洗滌1次，加入1毫升β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15分鐘。固定時可以在搖床上緩慢搖動，以避免細(xì)胞結(jié)成團(tuán)塊。
b. 離心，吸除細(xì)胞固定液，用PBS或HBSS洗滌細(xì)胞3次，每次3分鐘。
c. 離心，吸除PBS或HBSS，每管加入0.5-1毫升染色工作液。染色工作液的配制方法參考表1。
d. 37℃孵育過夜。注意：37℃孵育不能在二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行。
e. 取部分染色后的細(xì)胞，滴加到載玻片上或6孔板內(nèi)，普通光學(xué)顯微鏡下觀察。如不能及時觀察計數(shù)，可以離心，去除染色工作液，然后加入1毫升PBS，4℃可以保存數(shù)天。如果離心，取細(xì)胞用于涂片，加上封片液封片后，4℃可以保存較長時間。
3. 對于組織切片：
a. 對于石蠟切片先按照常規(guī)方法進(jìn)行脫蠟和水化處理。對于冷凍切片直接按照以下步驟進(jìn)行。
b. 加入適當(dāng)體積的β-半乳糖苷酶染色固定液，以充分蓋住組織為宜，室溫固定不少于15分鐘。
c. 用PBS浸泡洗滌組織3次，每次不少于5分鐘。
d. 吸除PBS，加入適當(dāng)量的染色工作液。染色工作液的配制方法參考表1。
e. 37℃孵育過夜，可以用parafilm或保鮮膜封住防止蒸發(fā)。最好把整個切片浸泡在染色工作液中。
注意：37℃孵育不能在二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行。
f. 普通光學(xué)顯微鏡下觀察。如不能及時觀察，加上封片液封片后4℃可以保存較長時間。

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