顯色法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit)為您提供了一種高靈敏度又快速簡便的細(xì)胞凋亡檢測方法。對(duì)于待檢測的細(xì)胞或組織樣品，經(jīng)過生物素標(biāo)記和后續(xù)的DAB顯色等步驟，即可在普通光學(xué)顯微鏡下觀察到凋亡細(xì)胞。

細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA。細(xì)胞凋亡時(shí)抽提DNA進(jìn)行電泳檢測，可以發(fā)現(xiàn)180-200bp的DNA ladder。基因組DNA斷裂時(shí)，暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上生物素(Biotin)標(biāo)記的dUTP(Biotin-dUTP)，隨后和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的Streptavidin (Streptavidin-HRP)結(jié)合，最后在HRP的催化下通過DAB顯色來顯示凋亡細(xì)胞，從而可以通過普通光學(xué)顯微鏡檢測到凋亡的細(xì)胞，這就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法檢測細(xì)胞凋亡的原理。
本試劑盒有如下優(yōu)點(diǎn)。(1)高靈敏度：背景染色極低，陽性染色強(qiáng)，可以在單細(xì)胞水平檢測到細(xì)胞凋亡，同時(shí)由于凋亡早期就有 DNA斷裂，可以檢測到早期的細(xì)胞凋亡。(2)特異性好：TUNEL檢測時(shí)通常更容易標(biāo)記凋亡細(xì)胞，而不容易標(biāo)記壞死細(xì)胞。(3)快速：僅需約2-3個(gè)小時(shí)即可完成。(4)應(yīng)用范圍廣：可以用于檢測冷凍或石蠟切片中的細(xì)胞凋亡情況，也可以檢測培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞的凋亡情況。(5) 實(shí)測效果好：參考圖1。

圖1. 本試劑盒的檢測效果圖。A. HeLa細(xì)胞未處理或用DNase I室溫孵育10分鐘后的檢測效果圖。B. Hela細(xì)胞未處理或用10μM喜樹堿(Camptothecin)處理24小時(shí)后的檢測效果圖。圖中棕褐色為DAB染色陽性細(xì)胞。本圖中的染色實(shí)驗(yàn)均在12孔板中進(jìn)行。本圖僅作參考，不同的樣品不同的檢測條件，實(shí)際獲得的結(jié)果可能和上圖有較明顯的差別。

TUNEL法特異性檢測細(xì)胞凋亡時(shí)產(chǎn)生的DNA斷裂，但不會(huì)檢測出射線等誘導(dǎo)的DNA斷裂(和細(xì)胞凋亡時(shí)的斷裂方式不同)。這樣一方面可以把凋亡和壞死區(qū)分開，另一方面也不會(huì)把射線等誘導(dǎo)發(fā)生DNA斷裂的非凋亡細(xì)胞判斷為凋亡細(xì)胞。
極少數(shù)細(xì)胞凋亡時(shí)沒有DNA斷裂，此時(shí)不適用TUNEL法檢測。在個(gè)別類型的壞死細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)TUNEL檢測呈陽性。在需要嚴(yán)格判斷細(xì)胞凋亡的情況下，最好同時(shí)檢測多個(gè)凋亡指標(biāo)。
本試劑盒足夠檢測20個(gè)樣品。 
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，DAB顯色液A和DAB顯色液B需避光保存。
注意事項(xiàng)：
需自備用于洗滌細(xì)胞的PBS或HBSS，用于封片的抗熒光淬滅封片液(P0126)等適當(dāng)?shù)姆馄�液，用于固定�?%多聚甲醛或免疫染色固定液(P0098)，同時(shí)需自備含0.3% Triton X-100的PBS，免疫染色強(qiáng)力通透液(P0097)。需自備過氧化氫。
如果用于石蠟切片的檢測，需自備蛋白酶K和二甲苯。蛋白酶K(ST533)
DAB對(duì)人體有害，操作時(shí)請(qǐng)小心，并注意有效防護(hù)以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1. 對(duì)于貼壁細(xì)胞或細(xì)胞涂片：
a.用PBS或HBSS洗滌1次。
b.如果細(xì)胞貼得不牢，可以干燥樣品使細(xì)胞貼得更牢。
c.用4%多聚甲醛或免疫染色固定液(P0098)固定細(xì)胞30分鐘。
d.用PBS或HBSS洗滌1次。
e.加入免疫染色強(qiáng)力通透液(P0097)或含0.3% Triton X-100的PBS，室溫孵育5分鐘。
f.用PBS或HBSS洗滌1次。
g.在內(nèi)源性過氧化物酶封閉液(P0100A)或PBS配制的0.3%過氧化氫溶液(0.3% H2O2 in PBS)中室溫孵育20分鐘，以滅活切片內(nèi)源的過氧化物酶。隨后用PBS或HBSS洗滌3次。
h. 轉(zhuǎn)步驟5。
2.對(duì)于懸浮細(xì)胞或細(xì)胞懸液：
a.收集細(xì)胞(不超過200萬細(xì)胞)，用PBS或HBSS洗滌1次。
b.涂片，使細(xì)胞粘附在載玻片上�？梢愿稍飿悠肥辜�(xì)胞貼得更牢，或使用適當(dāng)?shù)恼掣皆噭��?br />c.用免疫染色固定液(P0098)或4%多聚甲醛固定細(xì)胞30分鐘。
d.用PBS或HBSS洗滌1次。
e.用加入免疫染色強(qiáng)力通透液(P0097)或含0.3% Triton X-100的PBS，室溫孵育5分鐘。
f.用PBS或HBSS洗滌1次。
g.在內(nèi)源性過氧化物酶封閉液(P0100A)或PBS配制的0.3%過氧化氫溶液(0.3% H2O2 in PBS)中室溫孵育20分鐘，以滅活切片內(nèi)源的過氧化物酶。隨后用PBS或HBSS洗滌3次。
h.轉(zhuǎn)步驟5。
3.對(duì)于石蠟切片：
a.二甲苯中脫蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10分鐘。無水乙醇5分鐘。90%乙醇2分鐘。70%乙醇2分鐘，蒸餾水2分鐘。
b.滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K(推薦使用ST532/ST533 蛋白酶K(20mg/ml)，用P0106 免疫染色洗滌液或10mM Tris-HCl pH7.4-7.8稀釋1000倍即為20μg/ml不含DNase的蛋白酶K)，20-37℃作用15-30分鐘(不同組織的 最佳作用溫度和時(shí)間需自行摸索)。
c.用PBS或HBSS洗滌3次。注意：這一步必須把蛋白酶K洗滌干凈，否則會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)。
d.在內(nèi)源性過氧化物酶強(qiáng)力封閉液(P0100B)或PBS配制的3%過氧化氫溶液(3% H2O2 in PBS)中室溫孵育20分鐘，以滅活切片內(nèi)源的過氧化物酶。隨后用PBS或HBSS洗滌3次。注：請(qǐng)勿在用PBS配制的3%過氧化氫溶液中孵育過長時(shí)間，否則會(huì)出現(xiàn)過氧化氫導(dǎo)致的DNA斷裂，從而產(chǎn)生假陽性。
e.轉(zhuǎn)步驟5。
4.對(duì)于冷凍切片：
a.用免疫染色固定液(P0098)或4%多聚甲醛固定細(xì)胞30分鐘。
b.PBS或HBSS洗滌2次，每次10分鐘。
c.加入免疫染色強(qiáng)力通透液(P0097)或含0.3% Triton X-100的PBS，室溫孵育5分鐘。
d.在源性過氧化物酶封閉液(P0100A)或PBS甲醇配制的0.3%過氧化氫溶液(0.3% H2O2 in PBS)中室溫孵育20分鐘，以滅活切片內(nèi)源的過氧 化物酶。隨后用PBS或HBSS洗滌3次。
e.轉(zhuǎn)步驟5。
5.配制生物素標(biāo)記液：
參考下表配制適量的生物素標(biāo)記液，需充分混勻。注意：配制好的生物素標(biāo)記液必須一次使用完畢，不宜凍存。

6.樣品的生物素標(biāo)記：
a.在樣品上加50μl生物素標(biāo)記液，37℃避光孵育60分鐘。注意：50μl生物素標(biāo)記液適合涂片、切片或96孔板、48孔板、24孔板或12孔板的一個(gè)孔，如果是6孔板中的一個(gè)孔生物素標(biāo)記液宜使用100μl。如果待檢測的樣品為涂片、切片或在24孔板、12孔板或6孔板中，可以使用防蒸發(fā)膜，或自行嘗試使用自封袋或者其它適當(dāng)材料自行裁剪成比孔略小的圓形塑料片，滴加生物素標(biāo)記液后覆蓋在樣品上，可以防止生物素標(biāo)記液蒸發(fā)，并且使生物素標(biāo)記液均勻覆蓋樣品。自行裁剪圓片時(shí)需要連著圓片突出一個(gè)角或連著一條，并將圓形之外的突出部分折疊，方便染色結(jié)束后利用突出部分順利取出圓片。也可以用PAP Pen圈出一個(gè)區(qū)域進(jìn)行染色。孵育時(shí)需注意在多余的孔和多孔板的空隙中加入適量水以保持濕潤，從而盡量減少生物素標(biāo)記液的蒸發(fā)。
b.用PBS或HBSS洗滌1次，滴加0.1-0.3ml標(biāo)記反應(yīng)終止液，室溫孵育10分鐘。
c.用PBS或HBSS洗滌3次。
7.Streptavidin-HRP工作液和DAB顯色液的配制：
a.Streptavidin-HRP工作液的配制：
參考下表配制適量的Streptavidin-HRP工作液，需充分混勻。注意：配制好的Streptavidin-HRP工作液必須一次使用完畢，不宜凍存。

b.DAB顯色液的配制：
按照每個(gè)樣品使用0.2-0.5ml顯色液的比例配制適量DAB顯色液。等體積混合適量DAB顯色液A和DAB顯色液B，充分混勻后即為DAB顯色液。注意：配制好的DAB顯色液必須一次使用完畢，不宜凍存。
8.樣品的顯色：
a.在樣品上加50μl Streptavidin-HRP工作液，室溫孵育30分鐘。注意：50μl Streptavidin-HRP工作液適合涂片、切片或96孔板、48孔板、24孔板或12孔板的一個(gè)孔，如果是6孔板中的一個(gè)孔Streptavidin-HRP工作液宜使用100μl。如果待檢測的樣品為切片、涂片或在24孔板、12孔板或6孔板中，可以使用防蒸發(fā)膜，或自行嘗試使用自封袋或者其它適當(dāng)材料自行裁剪成比孔略小的圓形塑料片，滴加Streptavidin-HRP工作液后覆蓋在樣品上，可以防止Streptavidin-HRP工作液蒸發(fā)，并且使Streptavidin-HRP工作液均勻覆蓋樣品。自行裁剪圓片時(shí)需要連著圓片突出一個(gè)角或連著一條，并將圓形之外的突出部分折疊，方便染色結(jié)束后利用突出部分順利取出圓片。也可以用PAP Pen圈出一個(gè)區(qū)域進(jìn)行染色。孵育時(shí)需注意在多余的孔和多孔板的空隙中加入適量水以保持濕潤，從而盡量減少Streptavidin-HRP工作液的蒸發(fā)。
b.用PBS或HBSS洗滌3次。
c.滴加0.2-0.5mlDAB顯色液，室溫孵育5-30分鐘或根據(jù)顯色情況孵育適當(dāng)時(shí)間。注：如果顯色很強(qiáng)可以短于5分鐘 即停止顯色，如果顯色很弱，可以適當(dāng)延長顯色時(shí)間，甚至顯色過夜。
d.用PBS或HBSS洗滌3次。
e.染色效果可參見圖1或圖2。
f.選做(本步驟可以不做)：用蘇木素染色液(C0107)或甲基綠染色液(C0115)進(jìn)行細(xì)胞核染色。隨后用PBS或HBSS洗滌3次。
g.直接進(jìn)行觀察，或用95%乙醇脫水5分鐘，再用100%乙醇脫水2次，每次約3分鐘，再用二甲苯透明2次，每次5分鐘，隨后封片觀察。 染色結(jié)果可參考圖2：

圖2.TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(顯色法)用于小鼠睪丸切片的檢測效果圖。睪丸組織未處理(Control)或經(jīng)DNase I處理60min后(DNase I)，用本試劑盒進(jìn)行檢測(TUNEL)，或本試劑盒檢測后再用蘇木素復(fù)染(TUNEL+Hematoxylin)。TUNEL染色陽性的凋亡細(xì)胞顯棕色，蘇木素染色的細(xì)胞核顯藍(lán)色，被TUNEL染色呈現(xiàn)陽性的細(xì)胞通常不能再被蘇木素染色。實(shí)際檢測效果會(huì)因樣品和檢測條件的不同而存在差異，本圖僅作參考。

常見問題：
1.出現(xiàn)非特異性顯色。
a.有些細(xì)胞或組織，例如平滑肌細(xì)胞或組織，nuclease或polymerase的酶活性水平較高，易導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性的顯色。解決方法是， 取細(xì)胞或組織后立即固定并且要充分固定，以阻止這些酶導(dǎo)致假陽性。
b.使用了不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ�，例如一些酸性固定液，�?dǎo)致出現(xiàn)假陽性。建議采用推薦的固定液。
c.TUNEL檢測反應(yīng)時(shí)間過長，或TUNEL檢測反應(yīng)過程中反應(yīng)液滲漏，細(xì)胞或組織表面不能保持濕潤，也可能出現(xiàn)非特異性染色。注意控制反應(yīng)時(shí)間，并確保TUNEL檢測反應(yīng)液能很好地覆蓋樣品。
2.染色背景很高。
a.支原體污染。請(qǐng)使用支原體染色檢測試劑盒檢測是否為支原體污染。支原體染色檢測試劑盒(C0296)可以向訂購。
b.高速分裂和增殖的細(xì)胞，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核中的DNA斷裂。
c.TUNEL反應(yīng)過強(qiáng)�？梢杂迷噭┖刑峁┑腡dT酶稀釋液稀釋TdT酶2-5倍后再按照說明書操作。稀釋后的TdT酶需當(dāng)日使用。
d.細(xì)胞內(nèi)的過氧化物酶滅活不充分會(huì)導(dǎo)致很多細(xì)胞呈現(xiàn)陽性染色，改進(jìn)過氧化物酶的滅活方法，例如延長滅活時(shí)間等會(huì)有所幫助。
e.所使用的溶液有DNA酶污染。DNA酶污染導(dǎo)致的隨即切割會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生一定的背景并干擾檢測。把溶液高壓滅菌可以有效滅活各種常見 DNA酶。
3.標(biāo)記效率低。
a.使用乙醇或甲醇固定會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記的效率較低。
b.固定時(shí)間過長，導(dǎo)致交聯(lián)程度過高。此時(shí)宜減少固定時(shí)間。
c.貼壁細(xì)胞如果使用藥物誘導(dǎo)凋亡，會(huì)使發(fā)生凋亡細(xì)胞的貼壁性會(huì)減弱，所以建議在凋亡誘導(dǎo)結(jié)束后，用可以對(duì)多孔板進(jìn)行離心的離心機(jī)1000g離心5分鐘，然后再吸除培養(yǎng)基并用PBS洗滌。如果沒有適合的離心機(jī)，請(qǐng)注意操作輕緩，防止發(fā)生凋亡的細(xì)胞在洗滌時(shí)洗去。后續(xù)整個(gè)操作也需要輕緩。

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