Calcein AM，中文名鈣黃綠素乙酰氧基甲酯，是一種可滲透進(jìn)入細(xì)胞、常用于測定真核細(xì)胞活力或線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(Mitochondrial Permeability Transition Pore, MPTP)的綠色熒光探針。Calcein AM近年來被廣泛應(yīng)用到細(xì)胞活性分析實(shí)驗中。

Calcein AM (Calcein Acetoxymethyl Ester，中文名稱為鈣黃綠素AM或鈣黃綠素乙酰氧基甲酯)，是在Calcein (鈣黃綠素)的基礎(chǔ)上增加了乙酰氧基甲酯(AM)基團(tuán)，加強(qiáng)了疏水性，因此能夠輕易穿透活細(xì)胞膜。Calcein AM本身并無熒光，進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞中內(nèi)源性酯酶水解生成具有強(qiáng)負(fù)電荷的不能通透細(xì)胞膜的極性分子鈣黃綠素(Calcein)，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)，而Calcein可發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。與其它同類探針相比，由于Calcein AM的細(xì)胞毒性非常低，幾乎不會影響細(xì)胞功能如細(xì)胞增殖或淋巴細(xì)胞的趨化性等，而且對pH值敏感性低，所以Calcein AM是目前染活細(xì)胞的最理想熒光探針之一。
由于死細(xì)胞缺乏酯酶，Calcein AM僅用于對活細(xì)胞的活力測試和短期標(biāo)記，而核酸紅色熒光染料碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)由于不能穿透活細(xì)胞的細(xì)胞膜而只能染色細(xì)胞膜完整性被破壞的死細(xì)胞，所以Calcein AM常常與碘化丙啶(ST511)聯(lián)合使用，對活細(xì)胞和死細(xì)胞同時進(jìn)行雙重?zé)晒馊旧��?/span>
Calcein AM可以應(yīng)用于大多數(shù)的哺乳動物細(xì)胞。有報道稱Calcein AM也可以用于某些植物細(xì)胞如擬南芥(Arabidopsis)的根邊緣樣細(xì)胞(root border-like cells)及某些酵母如Pichia anomala和Saccharomyces cerevisiae。某些寄生蟲如Leishmania由于細(xì)胞膜組分的原因，Calcein AM不能進(jìn)入活細(xì)胞，但卻可以進(jìn)入凋亡早期的寄生蟲細(xì)胞，從而與PI聯(lián)用用于檢測凋亡早期的寄生蟲。由于真菌和細(xì)菌有細(xì)胞壁，會阻礙Calcein進(jìn)入細(xì)胞，因此Calcein AM不適合用于真菌和細(xì)菌。
Calcein本身是一種金屬絡(luò)合指示劑，在生理pH條件下和Co2+、Ni2+、Cu2+、Fe3+和Mn2+等金屬離子絡(luò)合時，熒光信號會發(fā)生淬滅。Calcein AM及其水解產(chǎn)物Calcein的分子結(jié)構(gòu)式參考圖1。

圖1. Calcein AM及其水解產(chǎn)物Calcein的分子結(jié)構(gòu)式。

Calcein AM分子式為C46H46N2O23，分子量為994.86，CAS號為148504-34-1。水解產(chǎn)物Calcein的最大激發(fā)光波長為494nm，最大發(fā)射光波長為514nm。Calcein的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考圖2。

圖2. Calcein的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。

本Calcein AM純度高，>95.5%，溶解在無水DMSO中，濃度為2mM。Calcein AM的常用終濃度為0.1-5μM，為得到比較理想的結(jié)果，請根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗實(shí)際情況對Calcein的最終濃度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
按Calcein AM最終工作濃度為0.1-5μM計算，本產(chǎn)品2mM×0.1ml包裝可以配制40-2000ml的染色工作液，2mM×0.5ml包裝可以配制0.2-10L的染色工作液。
包裝清單：

保存條件：
-20℃避光保存，一年有效。
注意事項：
熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
Calcein AM在潮濕環(huán)境中容易分解，并避免反復(fù)凍融，收到產(chǎn)品后建議分裝并-20℃密封保存。
由于Calcein AM在PBS等水溶液中不穩(wěn)定，配制成工作液后需盡快使用。
培養(yǎng)液中的血清和酚紅對Calcein AM的染色有一定的影響，建議在加入Calcein AM工作液前充分洗滌細(xì)胞。
Calcein AM標(biāo)記的細(xì)胞，熒光均勻，而且對短期細(xì)胞遷移示蹤效果非常好，但熒光的持續(xù)時間與細(xì)胞類型、培養(yǎng)條件等因素相關(guān)，一般在幾小時之內(nèi)，而且有時也會被某些類型細(xì)胞迅速外排。如果需要長時間標(biāo)記細(xì)胞，請使用CFDA SE (C1031)等熒光探針。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.Calcein AM染色工作液的配制：
用合適的緩沖液，如無血清培養(yǎng)液、HBSS (C0218)或PBS (C0221A/C0221D)稀釋2mM的本產(chǎn)品，配制成濃度為0.1-5µM的Calcein AM染色工作液。
注：Calcein AM的最終濃度建議根據(jù)細(xì)胞類型和實(shí)驗實(shí)際情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
2.懸浮細(xì)胞的熒光顯微鏡檢測或熒光酶標(biāo)儀檢測：
a.細(xì)胞按實(shí)驗設(shè)計進(jìn)行一定處理后，計數(shù)。取適當(dāng)細(xì)胞250×g室溫離心5min，棄上清，加入適當(dāng)體積的Calcein AM染色工作液使細(xì)胞密度約為1×106/ml。
b.37℃孵育細(xì)胞30-45min，不同的細(xì)胞最佳孵育時間不同�？梢钥紤]以30min作為初始孵育時間，根據(jù)具體的實(shí)驗情況進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化得到更加理想的檢測效果。
c.孵育結(jié)束后，250×g離心5min，吸除上清液，緩慢加入37℃預(yù)熱的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。
d.重復(fù)步驟c兩次或以上以充分洗滌去除殘留的染色液。
e.更換新鮮的37℃預(yù)熱的培養(yǎng)液，37℃再避光孵育30分鐘，以保證細(xì)胞內(nèi)酯酶充分水解Calcein AM以生成有綠色熒光的Calcein。
f.250×g室溫離心5min，吸除大部分培養(yǎng)液，用剩余培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸后涂片，在熒光顯微鏡下觀察或熒光酶標(biāo)儀檢測。Calcein的最大激發(fā)光波長為494nm，最大發(fā)射光波長為514nm。如有需要，也可進(jìn)行進(jìn)一步進(jìn)行其它熒光的復(fù)染，例如使用Annexin V-PE細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(C1065)或Propidium Iodide/碘化丙啶(ST511)檢測細(xì)胞凋亡、Mito-Tracker Red CMXRos (C1049)檢測線粒體活力、Hoechst 33342活細(xì)胞染色液(C1027/C1028/C1029)染色細(xì)胞核等。注意整個過程均需避光操作。
3.貼壁細(xì)胞的熒光顯微鏡檢測或熒光酶標(biāo)儀檢測：
a.將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿、多孔細(xì)胞培養(yǎng)板或者細(xì)胞爬片上，按實(shí)驗設(shè)計對細(xì)胞進(jìn)行一定處理。
b.吸除培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞1-2遍。
c.加入適當(dāng)體積的Calcein AM染色工作液，輕輕晃動使染料均勻覆蓋所有細(xì)胞。一般96孔板每孔體積為100μl，24孔板每孔體積為250μl，12孔板每孔體積為500μl，6孔板每孔體積為1ml。
d.37℃避光孵育30-45min，不同的細(xì)胞最佳孵育時間有所不同。以30min作為初始孵育時間，根據(jù)所用細(xì)胞對孵育時間進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化以得到更加理想的染色效果。
e.孵育結(jié)束后，更換成新鮮的37℃預(yù)熱的培養(yǎng)液，37℃再避光孵育30min，以保證細(xì)胞內(nèi)酯酶充分水解Calcein AM以生成有綠色熒光的Calcein。
f.吸除培養(yǎng)液，用PBS清洗2-3次，然后加入無血清細(xì)胞培養(yǎng)液后即可在熒光顯微鏡下觀察或熒光酶標(biāo)儀檢測。Calcein的最大激發(fā)光波長為494nm，最大發(fā)射光波長為514nm。如有需要，也可進(jìn)一步進(jìn)行其它熒光的復(fù)染。例如使用Annexin V-PE細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(C1065)或Propidium Iodide/碘化丙啶(ST511)檢測細(xì)胞凋亡、Mito-Tracker Red CMXRos (C1049)檢測線粒體活力、Hoechst 33342活細(xì)胞染色液(C1027/C1028/C1029)染色細(xì)胞核等。注意整個過程均需避光操作。
4.流式細(xì)胞儀檢測：
a.貼壁細(xì)胞胰酶消化后用培養(yǎng)液重懸，懸浮細(xì)胞直接使用，計數(shù)，取適量細(xì)胞250×g室溫離心5min，棄上清，加入適當(dāng)體積的Calcein AM染色工作液，使細(xì)胞為單細(xì)胞懸液，并且細(xì)胞密度為約1×106/ml，每個樣品體積為1ml。注：需要準(zhǔn)備好僅含緩沖液的細(xì)胞樣品用作流式細(xì)胞儀檢測時的陰性對照，該緩沖液與配制Calcein AM染色工作液的緩沖液宜保持一致。
b.37℃避光孵育30min。
c.孵育完成后，250×g室溫離心5min收集細(xì)胞。每個樣品加入1ml緩沖液，輕輕重懸，250×g室溫離心5min收集細(xì)胞。注：本步驟可去除多余染料及可能引起熒光淬滅的試劑。
d.用400µl緩沖液重懸細(xì)胞。如有需要，也可進(jìn)行進(jìn)一步染色。例如使用Annexin V-PE細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(C1065)或Propidium Iodide/碘化丙啶(ST511)檢測細(xì)胞凋亡、Mito-Tracker Red CMXRos (C1049)檢測線粒體活力、Hoechst 33342活細(xì)胞染色液(C1027/C1028/C1029)染色細(xì)胞核等。注意整個過程均需避光操作。染色后，將樣品置于冰上，可以在1小時內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測和分析。
e.注意使用僅含緩沖液的并且未經(jīng)染色的細(xì)胞樣品用于流式細(xì)胞儀的陰性對照設(shè)置。Calcein的最大激發(fā)光波長為494nm，最大發(fā)射光波長為514nm。​