生產(chǎn)的T4 RNA Ligase 2，即T4 RNA連接酶2，是一種ATP依賴的雙鏈RNA連接酶(double-strand RNA ligase, dsRNA Ligase)，也被稱為T4 Rnl2 (gp24.1)，可以用于雙鏈RNA進行分子內(nèi)的環(huán)化連接和分子間的線性連接。T4 RNA Ligase 2與T4 RNA Ligase 1 (R0621)不同的是，對雙鏈RNA中的缺刻(nick)的連接活性要大大高于對單鏈RNA末端的連接活性。T4 RNA Ligase 2也可用于雙鏈核酸(RNA雙鏈、RNA/DNA雜合鏈和/或DNA雙鏈)分子內(nèi)或分子間RNA鏈的3’羥基和DNA鏈的5’磷酸基的連接。T4 RNA Ligase 2連接時需要5’磷酸和3’羥基的存在，可以是RNA鏈或DNA鏈的5’磷酸基和RNA鏈的3’羥基之間發(fā)生連接反應。

T4 RNA Ligase 2催化dsRNA粘端連接的反應過程如下。首先T4 RNA Ligase 2直接消耗ATP，形成中間產(chǎn)物T4 RNA Ligase 2-AMP，并釋放焦磷酸；接著，T4 RNA Ligase 2-AMP與dsRNA的缺刻處相結合，并將AMP從中間產(chǎn)物T4 RNA Ligase 2-AMP中轉移至dsRNA缺刻處的5’磷酸末端，形成腺苷�；�缺刻dsRNA中間產(chǎn)物；最后，在T4 RNA Ligase 2的催化下，dsRNA缺刻處的3’羥基進攻該缺刻處的5’磷酸基團，形成3’-5’磷酸二酯鍵，并釋放出AMP。

本產(chǎn)品酶活性高，連接效率高于國外同類競爭產(chǎn)品。本產(chǎn)品催化雙鏈RNA粘端連接的效果請參考圖1。

圖1. 生產(chǎn)的T4 RNA Ligase 2和N公司的同類產(chǎn)品(Competitor T4 RNA Ligase 2)催化連接dsRNA粘端連接的效果圖。 RNA-1：5’-OH-GGGCUUUGCGUGGGUUU-OH-3’；RNA-2 (5’端磷酸化)：5’- pCUAUAGAAACCCACGCAAAGCCC-OH-3’，使用的R0051 Annealing Buffer for RNA oligos (5X)，參考說明書進行退火反應。退火獲得的dsRNA，在20µl反應體系中加入圖中指定量的本產(chǎn)品或國外N公司的T4 RNA Ligase 2 (T4 Rnl2)，37°C孵育30min進行連接反應，反應完畢后立即取樣用15%非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分析。如圖所示，本產(chǎn)品與N公司的產(chǎn)品相比，實際的連接效率約為N公司產(chǎn)品的2倍，在本反應體系中生產(chǎn)的T4 RNA Ligase 2僅需2U就可以非常充分地完成連接反應。

用途：主要用于連接雙鏈RNA中缺刻的連接(即雙鏈RNA的粘端連接)，也可用于雙鏈結構中，RNA 3’羥基與DNA 5’磷酸基的缺刻連接。

來源：大腸桿菌表達的重組蛋白，表達基因為T4嗜菌體T4 RNA ligase 2。

活性單位定義：：One unit is defined as the amount of enzyme required to ligate 0.4 µg of an equimolar mix of a 23-mer and 17-mer RNAs in a total reaction volume of 20 µl in 30 minutes at 37℃.

活性檢測條件：50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 400 µM ATP, 37℃孵育30min。

純度：不含DNA內(nèi)切酶和外切酶，不含RNA酶，不含磷酸酯酶。

酶儲存溶液：10 mM Tris-HCl (pH7.5), 50 mM KCl, 35 mM (NH4)2SO4, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM DTT, 50% (v/v) Glycerol.

10X Reaction Buffer：500 mM Tris-HCl (pH 7.5 at 25℃), 20 mM MgCl2, 10 mM DTT, 4 mM ATP.

失活或抑制：85℃加熱5min可使T4 RNA Ligase 2失活，或加入蛋白酶K或EDTA可抑制其活性。

包裝清單：

保存條件：

-20℃保存，至少一年有效。

注意事項：

如果連接底物為ssRNA，推薦使用生產(chǎn)的R0621 T4 RNA Ligase 1等系列產(chǎn)品。

可根據(jù)具體應用選擇合適的操作方法，可能需準備額外的試劑，如RNase Inhibitor、DEPC水等。

本產(chǎn)品提供的T4 Rnl2 Reaction Buffer (10X)適用于RNA雙鏈中缺刻的連接反應。如果用于RNA/DNA雜合鏈中RNA 3’羥基與DNA 5’磷酸基的缺刻連接時，需要將反應體系中的MgCl2的終濃度提高至10mM，并在反應體系中加入終濃度為10-15%的PEG8000，這樣可以顯著提高酶活性，同時不影響反應特性。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.雙鏈RNA或DNA/RNA雜合雙鏈的退火。

將兩條單鏈RNA等摩爾數(shù)混合，推薦的終濃度為20µM (10-50µM均可)，90℃孵育1min，然后通過梯度降溫至25℃退火形成dsRNA。推薦使用R0051 Annealing Buffer for RNA oligos (5X)，并按照該產(chǎn)品使用說明進行退火反應。DNA和RNA雜合鏈的退火也可以參考雙鏈RNA的退火條件進行。退火后的雙鏈推薦在-80℃保存。

2.對于雙鏈RNA缺刻的連接，參考下表在冰浴中配制如下反應體系：

注意：
a.由于涉及RNA操作，需要嚴格按照RNA操作的規(guī)范進行，避免RNase污染，相關試劑和耗材需要經(jīng)過DEPC處理去除RNase或者確保是RNase free的。本反應體系中涉及雙鏈RNA，雙鏈RNA可以耐受RNase A和T1等。如果涉及單鏈RNA，包括雙鏈退火后存在部分RNA序列是單鏈的情況，推薦適量添加R0102 RNase Inhibitor。
b.如果同時進行多個連接反應，可以把上表中除Nicked dsRNA Substrate之外的所有溶液和酶提前預混合，然后再分裝到各反應管內(nèi)。
c.反應體系中的Nicked dsRNA Substrate的最終濃度可以達到1µM，在該反應體系中可以確保充分連接。實際使用過程中，例如由于底物量有限等原因，可以適當減少Nicked dsRNA Substrate的用量，例如使最終濃度為0.5µM或0.2µM等。
3.對于RNA/DNA雜合鏈中RNA 3’羥基與DNA 5’磷酸基的缺刻連接，參考下表在冰浴中配制如下反應體系：

注意：
a.由于涉及RNA操作，需要嚴格按照RNA操作的規(guī)范進行，避免RNase污染，相關試劑和耗材需要經(jīng)過DEPC處理去除RNase或者確保是RNase free的。本反應體系中涉及雙鏈RNA，雙鏈RNA可以耐受RNase A和T1等。如果涉及單鏈RNA，包括雙鏈退火后存在部分RNA序列是單鏈的情況，推薦適量添加R0102 RNase Inhibitor。
b.如果同時進行多個連接反應，可以把上表中除Nicked DNA/RNA Substrate之外的所有溶液和酶提前預混合，然后再分裝到各反應管內(nèi)。
c.反應體系中的Nicked dsRNA Substrate的最終濃度可以達到1µM，在該反應體系中可以確保充分連接。實際使用過程中，例如由于底物量有限等原因，可以適當減少Nicked dsRNA Substrate的用量，例如使最終濃度為0.5µM或0.2µM等。
4.連接反應：37℃孵育30min。如果發(fā)現(xiàn)效果欠佳可以嘗試25℃孵育2h。為了使連接反應更加充分，可以適當延長連接反應時間。
5.終止反應：反應結束后加入蛋白酶K或EDTA，即可終止反應。

由于T4 RNA Ligase 2熱失活需要85℃加熱5min，這樣可能導致dsRNA或DNA/RNA雜合雙鏈變性，因此通常不建議通過加熱方式失活T4 RNA Ligase 2。如果后續(xù)無需保持雙鏈狀態(tài)，則推薦85℃加熱5min以失活T4 RNA Ligase 2。

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