EdU細胞增殖檢測試劑盒(DAB法)(EdU Cell Proliferation Kit with DAB)，是一種基于DNA合成過程中胸腺嘧啶脫氧核苷(thymidine)類似物EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)的摻入，并通過隨后的點擊反應(yīng)(Click reaction)使EdU被生物素(Biotin)所標記，然后加入的辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素(HRP-Streptavidin)與生物素結(jié)合，最后通過DAB顯色，從而實現(xiàn)簡單、快速、高靈敏地檢測細胞增殖的試劑盒。

本試劑盒可以檢測到細胞或組織樣品中單個的增殖細胞，同時也可以對細胞或組織樣品總體的細胞增殖情況進行定量檢測。本試劑盒可以檢測培養(yǎng)的細胞或組織樣品，也可以檢測組織切片，但均需提前進行EdU的摻入。
細胞增殖能力的檢測是評估細胞活性、基因毒性和抗腫瘤藥物效果等的基本方法。公認的最精確的檢測細胞增殖的方法是直接檢測細胞中DNA的合成。最初廣泛使用的通過檢測DNA合成來檢測細胞增殖的方法是放射性標記核苷摻入法，如氚標記胸腺嘧啶脫氧核苷([3H]thymidine)摻入法。但該方法由于有放射性污染并且很難實現(xiàn)單細胞檢測而受到很大的限制，隨后逐漸被基于抗體檢測的BrdU(bromo-deoxyuridine)法所替代。BrdU法步驟繁多，且需要使用BrdU抗體，影響因素較多，穩(wěn)定性比較差。并且由于BrdU法需要使用抗體，有時會和其它目的蛋白基于抗體的檢測相互產(chǎn)生干擾。EdU法基于EdU摻入和后續(xù)的點擊反應(yīng)，無需使用抗體、操作便捷、檢測靈敏度高，是一種在BrdU法基礎(chǔ)上升級換代的新方法，將會逐步取代BrdU法。
MTT法(C0009)、WST-1法(C0035、C0036)、CCK-8法(C0037、C0038、C0039、C0040、C0041、C0042、C0043、C0046)和CellTiter-Lumi™化學(xué)發(fā)光法(C0065、C0068)都是基于細胞活性的細胞增殖檢測方法，能檢測到細胞的總體增殖效果，但無法檢測到單個的增殖細胞。這幾種方法盡管都不是檢測DNA合成的，但被廣泛用于替代[3H]thymidine摻入法。CFDA SE法(C0051、C1031)基于細胞熒光示蹤的原理能檢測到單個的增殖細胞，但由于每增殖一次熒光減弱一半，在熒光顯微鏡下較難區(qū)分熒光減弱一半的細胞，檢測靈敏度不是很高，通常僅適用于流式細胞儀檢測。在進行科學(xué)研究時，上述這些基于細胞活性或CFDA SE的方法可以作為EdU法的補充性檢測方法。
EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)，中文名為5-乙炔基-2' -脫氧尿苷，是一種新型胸苷(胸腺嘧啶脫氧核苷，thymidine)類似物，EdU可以在DNA合成過程中替代胸苷摻入到新合成的DNA中。另一方面，EdU上的乙炔基能與生物素標記的疊氮化物(Biotin labeled azide)通過一價銅離子的催化發(fā)生共價反應(yīng)，形成穩(wěn)定的三唑環(huán)，該反應(yīng)非常迅速，被稱作點擊反應(yīng)(Click reaction)，其反應(yīng)原理參見圖1。通過點擊反應(yīng)，新合成的DNA會被相應(yīng)的生物素探針所標記，從而可以使用適當?shù)臋z測設(shè)備檢測到增殖的細胞。

圖1. EdU檢測法中的點擊反應(yīng)(Click reaction)原理圖。生物素或熒光探針等標記的疊氮化物(Labeled Azide)與摻入到細胞DNA中的EdU，在銅離子的催化發(fā)生共價反應(yīng)，形成穩(wěn)定的三唑環(huán)，最終使細胞DNA標記上生物素等探針。

本試劑盒反應(yīng)簡單、檢測靈敏度高。本試劑盒基于簡單高效的點擊反應(yīng)，無需DNA變性，只需少量的小分子疊氮化物探針即可非常有效地標記出摻入的EdU，并且可以檢測到單個細胞的增殖情況。
本試劑盒使用便捷、兼容性好。本試劑盒只需常用的多聚甲醛固定和Triton X-100穿透，就可以使疊氮化物探針有效進入細胞并發(fā)生點擊反應(yīng)，不會影響細胞形態(tài)，不會影響基于抗體的免疫熒光和免疫組化檢測，也不會影響DNA的熒光染色(如PI染色檢測細胞周期、DAPI或Hoechst染料檢測細胞核)。而BrdU法為了使大分子的BrdU抗體進入細胞并與DNA上的BrdU結(jié)合，需要對雙鏈DNA進行變性處理(如酸變性、熱變性或者DNase消化等)，這種變性可能會影響細胞形態(tài)，影響后續(xù)的免疫熒光和免疫組化檢測、DNA的熒光染色等。BrdU法和 EdU法檢測原理的比較參見圖2。

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圖2. BrdU法和 EdU法檢測原理的比較。A. BrdU法需使用大分子的BrdU抗體，由于空間位阻，雙鏈DNA須變性后才能使BrdU抗體與BrdU結(jié)合。B. EdU法使用小分子標記的疊氮化物(Azide)，無需DNA變性，操作更便捷，兼容性好，檢測結(jié)果更加穩(wěn)定可靠。

本試劑盒檢測快速。相對于BrdU法，本試劑盒采用 EdU法檢測新合成的DNA，所需時間顯著縮短。
經(jīng)本試劑盒處理后，增殖的細胞呈棕色，可以用普通光學(xué)顯微鏡進行觀察。HeLa細胞用本試劑盒檢測細胞增殖的效果參見圖3。

圖3. HeLa細胞用本試劑盒檢測細胞增殖的效果圖。無EdU組觀察不到棕色染色(最左側(cè)一列)；EdU (10μM)孵育2小時組有明顯的棕色染色(中間一列)；而用10mM的DNA合成抑制劑羥基脲(Hydroxyurea)提前預(yù)處理0.5小時后，棕色染色顯著減弱，說明DNA合成被抑制后，EdU的摻入被顯著抑制(最右側(cè)一列)。

各種細胞增殖和細胞毒性檢測試劑盒的比較和選擇，請參考 http://www.beyotime.com/cell-proliferation.htm。
本試劑盒小包裝C0085S如果用于培養(yǎng)的細胞(6孔板)的檢測，可以檢測50個樣品，每個樣品的反應(yīng)體系為500μl的Click反應(yīng)液；如果用于96孔板檢測，可以檢測500個樣品，每個樣品的檢測體系為50μl的Click反應(yīng)液；如果用于12孔、24孔、48孔或384孔板樣品的檢測，分別可以檢測125、250、350和1250個樣品，每個樣品推薦的Click反應(yīng)液用量為200μl、100μl、70μl和20μl。小包裝如果用于冰凍或石蠟切片的檢測，可以檢測125-250個樣品，每個樣品的反應(yīng)體系為100-200μl的Click反應(yīng)液。大包裝C0085L可檢測樣品的數(shù)量為小包裝C0085S的4倍。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，一年有效。Biotin Azide、DAB顯色液A和DAB顯色液B須避光保存。
注意事項：
Click Additive配制成溶液后請注意適當分裝。如果溶解后有白色物質(zhì)析出，請上下顛倒多次，待全部溶解后使用。如果該溶液顏色變成棕色，說明該組分的有效成分已失效，請棄用。
DAB對人體有害，操作時請小心，并注意有效防護以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。

f. 去離子水或超純水。
g. 根據(jù)實驗要求：18×18mm蓋玻片，6孔板或其它多孔板。
2. 檢測體系的準備
a. 如下以6孔板或常規(guī)切片檢測體系為例，如果使用12孔板、96孔板或384孔板等孔板，檢測體系可以相應(yīng)按比例縮小。
b. 如果檢測的是懸浮細胞，請按常規(guī)的懸浮細胞的操作方式進行。例如和貼壁細胞相比，相關(guān)步驟需要增加離心步驟等。
3. 培養(yǎng)細胞的EdU標記及固定、洗滌和通透
a. 在6孔板中(如有必要可以加入蓋玻片)培養(yǎng)適當數(shù)量的細胞。細胞培養(yǎng)過夜并且恢復(fù)到正常狀態(tài)后，進行所需的藥物處理或者其它刺激處理等。
b. 配制2X的EdU工作液：由于EdU工作液是與培養(yǎng)液等體積加入到孔板中，所以需要配制成2X的工作液。推薦的EdU終濃度為10μM (1X)，用細胞培養(yǎng)液1:500稀釋EdU (10mM)即可得到2X的EdU工作液(20μM)。
注意：對于A549、HeLa和NIH/3T3等貼壁細胞，推薦EdU的使用終濃度為10μM。但細胞類型、培養(yǎng)液種類、細胞密度、細胞增殖速度等多方面的因素會影響EdU摻入到細胞中的量，因此初次使用時建議對EdU的使用濃度進行一定的摸索。如果之前使用過BrdU進行實驗，則可以參考BrdU的終濃度作為EdU的終濃度。
c. 將37℃預(yù)熱的2X的EdU工作液(20μM)，等體積加入6孔板中，使6孔板中的EdU終濃度變?yōu)?X。例如設(shè)計終濃度為10μM，原先6孔板中的培養(yǎng)基為1ml，則將1ml 2X的EdU工作液(20μM)加入到孔板中。如果培養(yǎng)基體積過大，可以先吸除適量的培養(yǎng)液，再加入等體積的2X的EdU工作液；或者可以減少工作液的體積并增加EdU的濃度，使最終培養(yǎng)液中的EdU濃度為10μM，例如2ml培養(yǎng)液中加入220微升0.1mM EdU。更換所有的培養(yǎng)液可能會對細胞的增殖有影響，因此不建議替換所有的培養(yǎng)液。
d. 繼續(xù)孵育細胞2小時。該孵育時間的長短取決于細胞生長速率，通常宜繼續(xù)孵育細胞周期10%左右的時間。對于常見的哺乳動物細胞如HeLa、3T3、HEK293等，細胞周期大約在18-25小時，孵育時間宜在2小時左右。人胚胎細胞的細胞周期約30分鐘，推薦的孵育時間為5分鐘；酵母細胞的細胞周期約3小時，推薦的孵育時間為20分鐘，增殖的神經(jīng)細胞其細胞周期約5天，推薦的孵育時間為1天。孵育時間小于45分鐘時，建議提高EdU的濃度；孵育時間大于20小時時，建議適當降低EdU的濃度。
e. EdU標記細胞完成后，去除培養(yǎng)液，并加入1ml固定液(可以使用免疫染色固定液P0098，或4%的多聚甲醛P0099)，室溫固定15分鐘。
f. 去除固定液，每孔用1ml洗滌液洗滌細胞3次，每次3-5分鐘。
g. 去除洗滌液，每孔用1ml通透液(可以使用免疫染色強力通透液P0097，免疫染色洗滌液P0106，或含0.3% Triton X-100的PBS)，室溫孵育10-15分鐘。
h. 去除通透液，每孔用1ml洗滌液洗滌細胞1-2次，每次3-5分鐘。
i. 再用內(nèi)源性過氧化物酶封閉液室溫孵育20分鐘，以滅活內(nèi)源的過氧化物酶。隨后用洗滌液洗滌3次，每次2分鐘。
j. 轉(zhuǎn)步驟5。
4. 動物體內(nèi)EdU的標記及切片樣品的處理
EdU可以通過注射或進食等適當方式進行動物的體內(nèi)標記。如下以小鼠為例，其它動物體內(nèi)EdU的標記請參考相關(guān)文獻。
a. 對于小鼠，可以按照10-200mg/kg的用量，把EdU用PBS配制成一定濃度，腹腔注射、特定組織或器官局部注射或者加入飲用水中。具體用量跟所用動物的種類、體重和使用方式有關(guān)，可以參考相關(guān)文獻，因此初次使用時建議對EdU的使用濃度進行一定的摸索，或者直接使用50mg/kg的濃度進行測試。如果之前使用過BrdU進行實驗，則可以參考BrdU的終濃度作為EdU的終濃度。EdU可以單獨購買ST067。
b. 4小時后或根據(jù)特定實驗確定的適當時間后，快速處死小鼠，取出所需的組織，按照常規(guī)步驟制作冰凍切片或石蠟切片。EdU標記的時間也可以參考相關(guān)文獻自行調(diào)整。
c. 對于冰凍切片：
(a) 加入適量固定液(可以使用免疫染色固定液P0098，或4%的多聚甲醛P0099)，室溫固定15分鐘。
(b) 去除固定液，用適量洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘。
(c) 去除洗滌液，用適量通透液(可以使用免疫染色強力通透液P0097，免疫染色洗滌液P0106，或含0.3% Triton X-100的PBS)，室溫孵育10-15分鐘。
(d) 去除通透液，用適量洗滌液洗滌1-2次，每次3-5分鐘。
(e) 抗原修復(fù)(選做)：如果同時需要進行目的蛋白的免疫熒光染色，并有必要進行抗原修復(fù)，可以使用適當?shù)目乖�修�?fù)液，例如P0090冰凍切片快速抗原修復(fù)液(5X)，或者自行配制的適當?shù)目乖�修�?fù)液進行抗原修復(fù)處理。
(f) 用內(nèi)源性過氧化物酶封閉液室溫孵育20分鐘，以滅活切片內(nèi)源的過氧化物酶。隨后用洗滌液洗滌3次，每次2分鐘。
(g) 轉(zhuǎn)步驟5。
d. 對于石蠟切片：
(a) 脫蠟：二甲苯中脫蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10分鐘。無水乙醇5分鐘，換新的無水乙醇3分鐘。95%乙醇3分鐘。85%乙醇3分鐘。75%乙醇3分鐘。50%乙醇3分鐘。PBS 5分鐘。
(b) 抗原修復(fù)(選做)：如果同時需要進行目的蛋白的免疫組化染色，可以使用適當?shù)目乖�修�?fù)液，例如P0081檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(50X)、P0083改進型檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(50X)、P0085 EDTA抗原修復(fù)液(50X)、P0086檸檬酸鈉-EDTA抗原修復(fù)液(40X)、P0088通用型強力抗原修復(fù)液(10X)、P0092漂片抗原修復(fù)液(10X)，或者自行配制適當?shù)目乖�修�?fù)液進行抗原修復(fù)處理。
特別注意：如果使用蛋白酶K或胰酶進行抗原修復(fù)，必須反復(fù)洗滌干凈，否則殘留的酶會嚴重干擾后續(xù)標記反應(yīng)。
(c) 用內(nèi)源性過氧化物酶封閉液室溫孵育20分鐘，以滅活切片內(nèi)源的過氧化物酶。隨后用洗滌液洗滌3次，每次2分鐘。
(d) 轉(zhuǎn)步驟5。
5. EdU檢測
注意：本步驟六孔板中每孔的反應(yīng)體系為500μl的反應(yīng)混合物。對于12、24、48、96和384孔板，每孔的反應(yīng)的體系分別為200μl、100μl、70μl、50μl和20μl的反應(yīng)混合物。對于較小的孔，單位培養(yǎng)面積的液體用量已經(jīng)適當增加，以有效避免液體蒸發(fā)可能帶來的負面影響。對于切片，可以根據(jù)切片大小，每個切片使用100-200μl的反應(yīng)混合物。如下以六孔板中的細胞樣品為例說明具體的操作方法，對于其它孔板或切片，僅每步溶液的用量按比例調(diào)整即可，其余方法相同。
a. 配制Click Additive Solution：對于C0085S，用1.3ml去離子水溶解一管Click Additive，混勻至全部溶解，即為Click Additive Solution；對于C0085L，加入10.4ml去離子水溶解試劑盒中提供的一瓶Click Additive，混勻至全部溶解，即為Click Additive Solution。配制后可以適當分裝，并-20℃保存。
b. 參考下表配制Click反應(yīng)液。注意：請嚴格按照下表中組分順序和體積配制Click反應(yīng)液，否則點擊反應(yīng)可能無法有效進行；同時，Click反應(yīng)液須在配制后15分鐘內(nèi)使用。

c. 去除上一步驟中的洗滌液。
d. 每孔加入0.5ml Click反應(yīng)液，輕輕搖晃培養(yǎng)板以確保反應(yīng)混合物可以均勻覆蓋樣品。
e. 室溫避光孵育30分鐘。孵育時需注意在多孔板的空隙中加水，或者對于切片宜使用濕盒(例如載玻片染色盒FSR958)來保持濕潤，以盡量減少反應(yīng)液的蒸發(fā)。
f. 吸除Click反應(yīng)液，用洗滌液洗滌3次，每次3-5分鐘。
6. Streptavidin-HRP工作液和DAB顯色液的配制：
a. Streptavidin-HRP工作液的配制：
參考下表配制適量的Streptavidin-HRP工作液，須充分混勻。注意：配制好的Streptavidin-HRP工作液必須一次使用完畢，不宜凍存。

b. DAB顯色液的配制：
按照每個樣品使用0.2-0.4ml顯色液的比例配制適量DAB顯色液。等體積混合適量DAB顯色液A和DAB顯色液B，充分混勻后即為DAB顯色液。注意：配制好的DAB顯色液必須一次使用完畢，不宜凍存。
7. 樣品的顯色：
a. 在樣品上加200μl Streptavidin-HRP工作液，室溫孵育30分鐘。
注意：Streptavidin-HRP工作液的用量以完全覆蓋樣品為準。孵育時需注意在多孔板的空隙中加水，或者對于切片宜使用濕盒(例如載玻片染色盒FSR958)來保持濕潤，以盡量減少Streptavidin-HRP工作液的蒸發(fā)。
b. 用洗滌液洗滌3次，每次2分鐘。
c. 滴加0.2-0.4ml DAB顯色液，室溫孵育5-30分鐘。
注：如果顯色很強可以短于5分鐘即停止顯色，如果顯色很弱，可以適當延長顯色時間，甚至顯色過夜。
d. 用洗滌液洗滌3次，即可終止顯色反應(yīng)。如有必要可以使用適當?shù)娜旧�液進行復(fù)染，如伊紅染色液C0109、甲基綠染色液C0115、蘇木素染色液C0107、DAPI染色液C1005等。普通光學(xué)顯微鏡或熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。​