產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
在非變性 PAGE 中，DNA 的遷移率除跟長(zhǎng)短相關(guān)外，還跟其構(gòu)象和結(jié)合的 蛋 白 質(zhì) 相 關(guān) ， 因 此 DNA 的 非 變 性 PAGE 電 泳 是 研 究 SSCP-PCR
（single-strand conformation polymorphism-PCR、單鏈 PCR 片段構(gòu)象多態(tài)性）和凝膠滯阻（Gel Shift）的重要研究手段。本產(chǎn)品就是專門用于 DNA非變性 PAGE 的試劑
盒，它具有下列特點(diǎn):
1. 一站式，用戶只需要準(zhǔn)備去離子水和樣品，不需要單獨(dú)優(yōu)化各種條件，十分方便。
2. 安全，免去了實(shí)驗(yàn)人員接觸粉末狀的有毒物品丙烯酰胺。
3. PAGE 電泳后可直接用于銀染等后續(xù)試驗(yàn)。
4. 可以用于 SSCP 和 Gel-Shift 實(shí)驗(yàn)。
5. 本產(chǎn)品足夠 30 次 mini PAGE 凝膠電泳。
6. 本產(chǎn)品只能用于科研
下面的操作步驟是以 SSCP-PCR 的非變性 PAGE 電泳為例，其他應(yīng)用請(qǐng)相應(yīng)修改相關(guān)參數(shù)。
1. PAGE 濃度的選擇：根據(jù) SSCP-PCR 和 Gel-Shift 的 DNA 長(zhǎng)度選擇PAGE 凝膠的濃度。5%的 PAGE 的有效分辨范圍為 80-500bp、8%的PAGE 的有效分辨范圍為 60-400bp、12%的 PAGE 的有效分辨范圍為40-200bp。
2. 體積的選擇：SSCP-PCR 檢測(cè)需要長(zhǎng)約 30-40cm 的測(cè)序膠板，Gel-Shift實(shí)驗(yàn)一般只使用長(zhǎng)度為 8-10cm 的 mini 凝膠，可以結(jié)合梳子的厚度，計(jì)算所需 PAGE 膠的體積。
3. 配制 PAGE 膠（下面以配制 100 mL PAGE 膠為例計(jì)算用量，配制更大體積的膠則需以此用量為基礎(chǔ)按比例增加）：
A：新鮮配制 10%的 APS（過(guò)硫酸銨）：稱量約 0.1 克硫酸銨干粉到一個(gè)1.5 mL EP 管中，按每 0.1 克過(guò)硫酸銨干粉加 1mL 自備去離子水的比例將水加到管中，搖晃到硫酸銨粉末全部溶解。配制好的 10%的APS 溶液可以在 4℃存放一周，超過(guò)一周不能再用。
B：新鮮配制 30%的丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺溶液（29:1）：將 2g 甲叉雙丙烯酰胺倒入到裝有 60g 丙烯酰胺的 250mL 棕色塑料瓶中，天平上去皮，加入 146 mL 自備的去離子水，充分搖晃直到溶解（約需
10-20 分鐘）。此溶液簡(jiǎn)稱為 30% AB 溶液，最好在一個(gè)月內(nèi)用完，4℃保存。
C：配 SSCP PAGE 膠：在一個(gè) 250mL 的三角瓶中，先按下表的用量加入去離子水、30% AB 溶液和 10×TBE 電泳液。丙烯酰胺單體溶液具有神經(jīng)毒性，一定要戴手套操作。
C：搖晃混勻。最好能抽真空 10-15 分鐘以去除溶液中的氧氣（氧氣能抑制丙烯酰胺聚合反應(yīng)），無(wú)條件也可以不脫氧。
D：加入 500uL 10%APS 和 100uL TEMED，迅速搖勻后倒膠。
E: 在 PAGE 膠的液面距離達(dá)到頂部時(shí)停止灌膠，插入梳子。
F: 室溫聚合 30-60 分鐘（低溫抑制聚合反應(yīng)，故最好室溫）。
G: 待 PAGE 膠凝固后拔出梳子，用 1×TEB 液沖洗加樣孔。
H: 放 4℃冰箱預(yù)冷 30 分鐘-12 小時(shí)。為了防止 PAGE 膠收縮，最好在其頂部加少量 1×TBE 緩沖液。使用預(yù)冷的 PAGE 膠有利于單鏈 DNA在電泳時(shí)保持其構(gòu)型，這些構(gòu)型靠 DNA 序列間的微弱的鏈內(nèi)互補(bǔ)形成，對(duì)溫度很敏感。溫度越高，這些微弱相互作用越不穩(wěn)定。
4. 將預(yù)冷后的 PAGE 凝膠板固定在電泳裝置上，往上槽和下槽中加入足夠 1×TEB 電泳液。
5. 取 3-5 uL SSCP-PCR 樣品，加入等體積 2×DNA 非變性 PAGE 上樣液，85℃處理 5 分鐘后冰浴。用前短暫離心后取 2 uL 上樣。上樣量跟檢測(cè)方法的靈敏度相關(guān)，上述上樣量是針對(duì)核酸銀染檢測(cè)法。
6. 連接電源線，打開電源開關(guān)。如果 PAGE 中不含甘油，則使用 25W 的功率，電泳 5-7 小時(shí)（對(duì) 3-40cm 長(zhǎng)的 PAGE 膠而言）。如果使用含甘油的pAGE，則使用 8W 的功率，電泳 16-18 小時(shí)。由于溫度變化過(guò)大會(huì)改變 DNA 構(gòu)型，所以電泳時(shí)最好能保持恒溫。對(duì)不含甘油的 PAGE，最好恒溫在 4℃、對(duì)含甘油的 PAGE，最好恒溫在 25℃。
1. 終止電泳，取出凝膠進(jìn)行后續(xù)的銀染處理。不建議使用靈敏度低于銀染的方法，因?yàn)?SSCP 異構(gòu)體的數(shù)量都比較少，一般方法沒(méi)法檢測(cè)到。
