PCR 標(biāo)記的原理是用帶標(biāo)記的 dNTP 進(jìn)行 PCR，最后得到的 PCR 產(chǎn)物將帶有標(biāo)記，可以直接用于雜交試驗(yàn)。本產(chǎn)品就是基于上述原理的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)，

它具有下列特點(diǎn)：

1. 一站式，本試劑盒提供經(jīng)過(guò)優(yōu)化的試劑，不需要用戶自己摸索。

2. 足夠 10 次 50 uL 體系的常規(guī) PCR（用于制備標(biāo)記反應(yīng)的模板和設(shè)置對(duì)照反應(yīng)）和 5 次 50 uL 體系的標(biāo)記反應(yīng)。

3. 一次標(biāo)記可以得到ug級(jí)的雙鏈DNA探針或約700ng 的單鏈DNA探針，足夠多次雜交實(shí)驗(yàn)用。

4. 既可用于制備雙鏈探針，也可以用于單鏈探針。

5. A 型需自備含標(biāo)記核苷酸的 dNTP， B 和 C 型分別含生物素和地高辛標(biāo)記的底物。可用的自備標(biāo)記底物包括 fluorescein-dUTP、hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP 和 aminoallyl-dUTP 等。

6. 摻入率一般為 4-5%，有效降低了空間阻礙，檢測(cè)效果最佳。

7. 標(biāo)記探針可以用于 Southern 和 Northern Blot、原位雜交、菌落和斑點(diǎn)印跡雜交等分析。

8. 本產(chǎn)品足夠 5 次非標(biāo)記 PCR 和 5 次標(biāo)記 PCR（均指 50uL 體系）。

規(guī)格及成分：

運(yùn)輸及保存： 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑 ：DNA 模板和模板專一性引物。

使用方法 一：準(zhǔn)備工作

1. 按常規(guī)的方法設(shè)計(jì) PCR 引物，使探針長(zhǎng)度在 400-800bp 之間。過(guò)短則標(biāo)記參入少，探針雜交信號(hào)強(qiáng)度減弱；過(guò)長(zhǎng)則非特異雜交增加，背景變強(qiáng)。

2. 由于標(biāo)記的 dNTP 比較珍貴，所以不推薦以基因組 DNA 或其他復(fù)雜 DNA為模板直接進(jìn)行 PCR 標(biāo)記，而是建議采取下述的兩步法標(biāo)記來(lái)提高成功率，即先制備非標(biāo)記 PCR 產(chǎn)物，再以之為模板制備標(biāo)記的 PCR 產(chǎn)物。

3. 對(duì) A 型標(biāo)記試劑盒，四種 10mM 的 dNTP 是分開(kāi)提供，用于制備 50uL非標(biāo)記 dNTP（2mM each，用于非標(biāo)記 PCR，用于制備標(biāo)記 PCR 的模板。配制方法是四種 10mM 的 dNTP 各加 10uL，再加水 10uL 即可）

和 25uL 標(biāo)記 dNTP（2mM each，其中標(biāo)記核苷酸和對(duì)應(yīng)的非標(biāo)記核苷酸的比例需要自行優(yōu)化，假如是 biotin 或 DIG 標(biāo)記的是 dUTP，則其對(duì)應(yīng)的非標(biāo)記核苷酸是 dTTP，兩者的最佳比例一般為 1：3；如果是BrdUTP，則兩者的最佳比例為 1：1。

配制方法是三種 10mM 的 dNTP各加 5uL，再加標(biāo)記核苷酸和其對(duì)應(yīng)的標(biāo)記核苷酸使其總的終濃度為2mM，再補(bǔ)水到 25uL）。

二：非標(biāo)記 PCR 產(chǎn)物的制備

4. 設(shè)置50uL非標(biāo)記PCR：2×標(biāo)記專用PCR Mix 25 uL，dNTP Mix（2mMeach）5uL，自備的探針引物（10pmol/uL）各 1uL，1 ug 基因組 DNA或 1ng 質(zhì)粒 DNA，補(bǔ)超純水到 50 uL。

5. 按已經(jīng)優(yōu)化的 PCR 參數(shù)進(jìn)行常規(guī) PCR。

6. 膠回 PCR 產(chǎn)物并定量，膠回收可以避免殘留引物干擾后續(xù)的標(biāo)記 PCR。

三：標(biāo)記 PCR 反應(yīng)（最好做一個(gè)不加標(biāo)記的對(duì)照用于定量）

注意：由于雙鏈 PCR 探針在雜交時(shí)變性的雙鏈彼此還會(huì)復(fù)性，降低雜交效率，因此強(qiáng)烈推薦使用單鏈標(biāo)記 PCR。

 注意：本試劑盒提供的 dNTP 混合物總濃度為 2mM，所含標(biāo)記 dUTP 與非標(biāo)記 dTTP 的比例已經(jīng)進(jìn)過(guò)優(yōu)化。

7. 按第 5 步的 PCR 參數(shù)進(jìn)行標(biāo)記 PCR，但需要進(jìn)行下列修改：一是循環(huán)數(shù)增加到 35-55 個(gè)循環(huán)。由于模板為純化后的 PCR 產(chǎn)物，探針對(duì)擴(kuò)增長(zhǎng)度完整性要求不高（長(zhǎng)度不均的探針由于能形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，效果反而更好），

所以可以增加循環(huán)數(shù)；二是延伸時(shí)間增加 15 秒，因?yàn)闃?biāo)記 dUTP 參入到DNA 的速度比常規(guī)的 dTTP 慢；三是降低復(fù)性溫度 5-7℃，因?yàn)闃?biāo)記核苷酸參入到 DNA 后，新模板的 Tm 值將降低。

8. 標(biāo)記探針的定量：取標(biāo)記反應(yīng)液和對(duì)照反應(yīng)液 1-5 uL，在瓊脂糖凝膠上跟濃度已知的 DNA marker 一起電泳，并判斷探針的濃度。由于標(biāo)記產(chǎn)物中額外帶有生物素，地高辛等、其泳動(dòng)速度將慢于非標(biāo)記 PCR 產(chǎn)物（但同位素標(biāo)記不能用此法）。下圖是一個(gè)典型的雙鏈 PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果圖：

注意：如果擴(kuò)增的是單鏈 DNA 探針，其結(jié)合 EB 的能力遠(yuǎn)低于雙鏈 DNA，因此 EB 染色的強(qiáng)弱不能準(zhǔn)確反應(yīng) DNA 的真實(shí)濃度，可以采用銀染定量（跟marker 比較）。一般 100ng 模板經(jīng)單鏈 PCR 擴(kuò)增可得到 700ng 左右探針。

9. 剩余的 PCR 標(biāo)記產(chǎn)物可以不經(jīng)過(guò)純化，直接加入（對(duì)單鏈 PCR 探針）雜或加熱變性并急冷后加入（對(duì)雙鏈 PCR 探針）到雜交液中使用。也可放-20℃長(zhǎng)期保存。如果需要純化，請(qǐng)使用乙酸銨/乙醇沉淀法純化。