Blasticidin S是來源于灰色鏈霉菌(Streptomyces griseochromogenes)的一種核苷類抗生素，中文名為滅瘟素S、殺稻瘟菌素S或稻瘟散，一般為鹽酸鹽。Blasticidin S常用于篩選攜帶bsr/BSD/bls基因(常標(biāo)記為bsrr/bsdr/Blastr)質(zhì)粒的哺乳動(dòng)物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，具有快速而強(qiáng)效的作用模式，很低的抗生素濃度便能使未攜帶抗性基因的細(xì)胞迅速死亡。
本產(chǎn)品10mg/ml包裝配制在HEPES (pH7.4)緩沖溶液中，濃度為10mg/ml，經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌，可以直接用于細(xì)胞培養(yǎng)。本產(chǎn)品10mg和50mg包裝為粉末裝。
Blasticidin S通過干擾核糖體結(jié)合肽段而特異性抑制原核細(xì)胞或真核細(xì)胞的蛋白合成。目前已經(jīng)有3種滅瘟素耐受基因，一種是分離自鏈霉菌(Streptoverticillum sp.)的乙�；D(zhuǎn)移酶基因bls；另外兩種是脫氨酶基因，分別是從蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)中分離的bsr和從土霉菌(Aspergillus terreus)中分離的BSD基因。bsr和BSD基因是最常用的篩選標(biāo)志，用于哺乳動(dòng)物和植物細(xì)胞的穩(wěn)定細(xì)胞株篩選。Blasticidin S也可用于大腸桿菌(E. coli)等原核細(xì)胞的篩選。
Blasticidin S具有快速而強(qiáng)效的作用模式，在很低的抗生素濃度下便能導(dǎo)致細(xì)胞快速死亡。大腸桿菌通常對(duì)50μg/ml的濃度敏感，而哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)低至2-10µg/ml的濃度敏感。細(xì)胞死亡迅速發(fā)生，通�？稍诓坏揭恢艿臅r(shí)間內(nèi)即可形成具有Blasticidin S抗性的穩(wěn)定哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。
化學(xué)性質(zhì)：
| 化學(xué)名 | (2S,3S,6R)-3-[[(3R)-3-amino-5-[carbamimidoyl(methyl)amino]pentanoyl]amino]-6-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-3,6-dihydro-2H-pyran-2-carboxylic |
| 化學(xué)式 | C17H26N8O5·HCl |
| 分子量 | 458.9 |
| CAS號(hào) | 3513-03-9 |
| 純度 | >95% |
保存條件：
-20℃保存，至少一年有效。10mg/ml包裝避免反復(fù)凍融。
注意事項(xiàng)：
本產(chǎn)品對(duì)人體有急性毒性，操作時(shí)請(qǐng)?zhí)貏e小心，并確保有效防護(hù)以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1.推薦工作濃度：推薦的作用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的Blasticidin S濃度一般為1-50μg/ml，但最佳工作濃度需要通過劑量反應(yīng)曲線來確定。
表1.部分常見哺乳動(dòng)物細(xì)胞的推薦工作濃度表
| 細(xì)胞名稱 | 細(xì)胞類型 | Blasticidin S濃度 |
| A549 | Human lung cancer | 10μg/ml |
| CHO | Chinese hamster ovarian | 5-10μg/ml |
| HEK293 | Human embryonic kidney | 5-15μg/ml |
| HeLa | Human cervical cancer | 2.5-10μg/ml |
| HepG2 | Human hepatocellular carcinoma | 4-5μg/ml |
| Neuro2a | Mouse neuroblasts | 30μg/ml |
| HT1080 | Human fibrosarcoma | 5-20μg/ml |
| MCF-7 | Human breast cancer | 2-5μg/ml |
| THP-1 | Human monocytes | 10μg/ml |
| B16 | Mouse melanoma tumor | 3-10µg/ml |
2.Blasticidin S劑量反應(yīng)曲線的確定
Blasticidin S的有效篩選濃度與細(xì)胞類型、生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞密度、細(xì)胞代謝及細(xì)胞所處細(xì)胞周期等因素相關(guān)。為了篩選到具有Blasticidin S抗性的穩(wěn)定細(xì)胞株，需要確定殺死未轉(zhuǎn)染/感染宿主細(xì)胞所需的Blasticidin S的最低濃度，可以通過實(shí)驗(yàn)來確定適合自身實(shí)驗(yàn)體系的劑量反應(yīng)曲線(dose-response curve or kill curve)。
a.第一天：將正常的細(xì)胞按照約25%的密度接種在適宜的細(xì)胞培養(yǎng)板上，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。
b.第二天：將培養(yǎng)過夜的細(xì)胞培養(yǎng)基換成新鮮的含不同濃度Blasticidin S的篩選用培養(yǎng)基，Blasticidin S濃度可以設(shè)置為0、2、4、6、8和10μg/ml等，每個(gè)濃度設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。注：也可以根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)體系，設(shè)置不同的濃度梯度。
c.每3-4天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，并觀察存活細(xì)胞的比例。
d.選擇在加入Blasticidin S后7-10天殺死大多數(shù)細(xì)胞的最低濃度為最佳篩選濃度。
3.哺乳動(dòng)物穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選
轉(zhuǎn)染含有bsr或BSD基因的質(zhì)�；蛘吒腥竞性摶虻牟《竞�，即可篩選穩(wěn)定表達(dá)株。
a.細(xì)胞轉(zhuǎn)染或感染48小時(shí)后，將細(xì)胞置于含有適當(dāng)濃度Blasticidin S的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，此為處理組。
注意：當(dāng)細(xì)胞處于分裂活躍期時(shí)，抗生素作用最明顯。細(xì)胞過于密集，抗生素產(chǎn)生的效力會(huì)明顯下降，所以細(xì)胞的密度最好不超過25%。建議同時(shí)做一個(gè)正常細(xì)胞的對(duì)照組。轉(zhuǎn)染或感染48小時(shí)后，如果細(xì)胞過密也可以消化后重新接種細(xì)胞，培養(yǎng)過夜后即可進(jìn)行Blasticidin S篩選。
b.每3-4天去除培養(yǎng)基，加入含Blasticidin S的新鮮培養(yǎng)基。
c.篩選7-10天后，對(duì)照組正常細(xì)胞應(yīng)該100%死亡，處理組中存活的細(xì)胞為表達(dá)bsr或BSD基因的細(xì)胞。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行多克隆或單克隆細(xì)胞的篩選。根據(jù)宿主細(xì)胞種類和轉(zhuǎn)染/篩選效率，集落形成可能需要一周或更多的時(shí)間。
d.克隆形成后，挑取并轉(zhuǎn)移5-10個(gè)抗性克隆到35mm細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入選擇培養(yǎng)基維持培養(yǎng)7天。隨后用細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。
