植物原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化試劑盒
產(chǎn)品簡介：
植物原生質(zhì)體是指脫去全部細胞壁由質(zhì)膜包被的具有生命活力的裸露細胞。它具有細胞生命特征和全能型，是細胞無性系變異和突變體篩選的重要來源，同時也是植物遺傳工程的理想受體 和遺傳改良的理想材料。酶解法分離原生質(zhì)體是一個常用的技術(shù)，其原理是植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶、離析酶和果膠酶能降解細胞壁成分，去除細胞壁，即可得到原生質(zhì)體。許多方法可誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合，現(xiàn)在被廣泛采用的融合方法是聚乙二醇 (PEG) 法。聚乙二醇 (PEG)作為一種高分子化合物，合適的濃度能對原生質(zhì)體產(chǎn)生瞬間沖擊效應(yīng)，原生質(zhì)體很快發(fā)生收縮與粘連，隨后用高鈣高pH法進行清洗，使原生質(zhì)體 融合得以完成。
按照每次使用5 ml酶消化體系計算，本試劑盒可用于40次酶消化反應(yīng)。本試劑盒每個5 ml反應(yīng) 體系可處理0.1 g左右的擬南芥葉片(約10~15葉片),操作較好的情況下每5 ml 體系可獲得約50-70 萬個原生質(zhì)體(不同植物不同操作會有一定的差異),可滿足約25-70個樣品的原生質(zhì)體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染操 作(按照每樣1-2萬個細胞計算)。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化時，按照每次轉(zhuǎn)化100 μl原生質(zhì)體溶液，轉(zhuǎn)化試劑可以完成至少40個樣品的轉(zhuǎn)化。
試劑盒組成：
| 組份貨號 | 名稱 | 規(guī)格 | 貯存 |
| 4052-01 | 溶液I-酶溶解溶液(2×) | 100 ml | -20℃ |
| 4052-02 | 溶液II-漂洗溶液 | 200 ml | -20℃ |
| 4052-03 | 溶液Ⅲ-重懸溶液 | 25 ml | -20℃ |
| 4052-04 | 溶液IV-轉(zhuǎn)化試劑 | 5 ml | -20℃ |
| 4052-05 | 溶液V-培養(yǎng)溶液 | 25 ml | -20℃ |
| BME | 還原劑 | 1 ml | RT |
| BSA-02 | BSA溶液(50mg/ml) | 5 ml | -20℃ |
貯存和運輸：
-20℃保存，至少一年有效。
組分4℃存放3-5天不會影響使用效果，長期不用則需按照標簽溫度貯存。
試劑盒冷藏運輸。
使用說明：
需要準備的材料(試劑盒不提供):
剪尖吸頭(剪尖后可以用酒精燈過火將吸頭處理平滑);纖維素酶R-10; 離 析 酶R-10; 平頭鑷子；70 μm細胞過濾篩； 一次性刀片；50 ml離心管；1.5 ml離心管；水浴鍋。
一 、原生質(zhì)體分離：
即用型酶溶液配制
| 組份 | 5 ml配制量 | 10 ml配制量 |
| 溶液I(2×) | 2.5 ml | 5 ml |
| 纖維素酶R-10 | 0.075克 | 0.15克 |
| 離析酶R-10 | 0.02克 | 0.04克 |
| 混勻后55℃水浴10 min，期間顛倒混勻2-3次， 冷卻至常溫后加入以下成分。 注：55℃ 孵育可以 有效滅活DNase和Protease,并促進酶溶解。 | ||
| BME | 2.5μl | 5 μl |
| 50mg/ml BSA | 0.1 ml | 0.2 ml |
| 滅菌水 | 定容至5 ml | 定容至10 ml |
注：即用型酶溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，不建議配制后凍存后再使用； 溶解好的正常酶溶液應(yīng)為澄清棕黃色溶液,如使用純度不好的酶，溶液為不溶解的乳白色懸濁液，不能使用。
1.1酶解：
取生長狀態(tài)良好的葉片切成0.5-1 mm 的小條，按照0.1 克葉片(擬南芥約15-20個葉片)加5 ml 即用型酶溶液的比例迅速將切割好的葉片小條浸泡于酶溶液中，避光，無需震蕩，常溫(20-25℃) 酶解3小時，間歇混勻。
注：酶解時間與葉片種類，葉片生長狀態(tài)有關(guān)，請根據(jù)實驗需要適當調(diào)整酶解時間。3小時為擬南芥葉片推薦的酶解 時間。如條件允許，可以使用微型真空泵常溫避光條件下抽真空30 min, 以使酶溶液更好地進入細胞間隙。酶溶液變 為綠色表明有原生質(zhì)體已經(jīng)有分離，溶液為濃綠色表明原生質(zhì)體已經(jīng)大量分離(左下圖)。擬南芥原生質(zhì)體大小約為30-50μm,顯微鏡鏡檢后確定是否分離。葉片原生質(zhì)體細胞顯微鏡下為綠色圓球狀，葉綠體分散在整個細胞內(nèi),說明狀態(tài)較好；如呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，說明原生質(zhì)體破碎或即將破碎。
1.2漂洗：
酶解后加入等體積的溶液IⅡ,如使用5 ml酶解體系，加入5 ml溶液Ⅱ,輕柔混勻。
1.3過濾：
用孔徑70 μm篩網(wǎng)(自備)過濾步驟2中的溶液，去除未消化的葉片，用5-10 ml溶液Ⅱ沖洗酶解器 皿和未消化的葉片1-2次，將所有的液體收到50 ml離心管中。
1.4第一次收集：
濾出液100 g 常溫離心2分鐘，盡量去除上清。
注：為了避免原生質(zhì)體離心時貼在管壁，建議整個實驗過程使用水平轉(zhuǎn)頭；離心時，可調(diào)低離心機的升速和降速。
升速過快，原生質(zhì)體可能離到管壁上；降速過快，可能導(dǎo)致管底原生質(zhì)體懸起。建議升速和降速分別都使用3。
1.5第二次收集：
加入2-5 ml 溶液Ⅱ,用剪尖的藍吸頭重懸原生質(zhì)體，冰浴30分鐘，原生質(zhì)體在重力作用下可以沉 降到離心管底部，盡量吸除上清，收集原生質(zhì)體。(如果發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)體沉降的速度比較慢或者得 率比較低，也可以考慮常溫100 g 離心1-2 min收集原生質(zhì)體)。
1.6重懸：
小心去除上清溶液，不要觸動原生質(zhì)體沉淀，沉淀用剪尖的藍吸頭重懸于1 ml溶液Ⅲ中即為原生 質(zhì)體溶液。(可以用血球計數(shù)板計數(shù)，根據(jù)原生質(zhì)體數(shù)量調(diào)整溶液Ⅲ的加入體積，使得原生質(zhì)體 密度為2×105/ml或更高)。
注：制備好的原生質(zhì)體可以在4℃或冰浴保存至少24 h。
二 、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)：
2.1轉(zhuǎn)化溶液配制：
植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化參考下表根據(jù)樣品量配制轉(zhuǎn)化溶液。
|
| 120μl(1個樣品) | 1.2 ml(10個樣品) | 5 ml(40個樣品) |
| 轉(zhuǎn)化試劑粉末 | 48 mg | 480 mg | 2 g |
| 轉(zhuǎn)化試劑溶解液(2×) | 60μl | 600μl | 2.5 ml |
| 滅菌水 | 定容至120μl | 定容至1.2 ml | 定容至5 ml |
注：轉(zhuǎn)化溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。轉(zhuǎn)化溶液需要在轉(zhuǎn)化前至少1小時配制，以確保轉(zhuǎn)化試劑溶解充分。轉(zhuǎn)化溶液配制后盡量 當天使用。配制好的轉(zhuǎn)化溶液4℃保存3-5天之內(nèi)仍然有較好的轉(zhuǎn)化效率，但和當天配制的轉(zhuǎn)化溶液相比，轉(zhuǎn)化效果 可能會有一定程度的下降。
2.2準備質(zhì)粒：
取10 μl 質(zhì)粒DNA(10-20 μg,濃度為1-2 μg/μl)于1.5 ml 離心管中。
注：質(zhì)粒大小建議為5-10 kb, 質(zhì)粒濃度為1-2 μg/μl左右；
原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化對于質(zhì)粒的純度要求較高，盡量使用高純度的質(zhì)粒。
2.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：
2.3.1質(zhì)粒管中加入100 μl原生質(zhì)體溶液(原生質(zhì)體密度為2×105/ml,約2萬個原生質(zhì)體),輕柔混勻。
2.3.2加入等體積即110 μl 步驟1事先準備好的轉(zhuǎn)化溶液，輕彈管底，混勻，常溫25℃放置5-15分鐘。 注：最長可以孵育15 min, 但通常孵育5 min 時間已經(jīng)足夠。最佳的孵育時間對于不同的原生質(zhì)體和不同的質(zhì)粒需 要通過實驗摸索。
2.4終止轉(zhuǎn)化：
加入2倍體積即440 μl溶液Ⅱ,輕柔徹底混勻，終止轉(zhuǎn)化過程。
2.5收集原生質(zhì)體：
常溫100 g 離心1-2分鐘，盡量去除上清。
注：由于轉(zhuǎn)化后的溶液會非常粘稠，加入溶液II后離心1 min 通�？梢允乖|(zhì)體聚集在管底，但使用某些突變體時 為減少原生質(zhì)體損失，可將離心時間延長到2 min。
2.6原生質(zhì)體漂洗：
加入500 μl溶液IⅡ輕輕重懸原生質(zhì)體，常溫100g離心1 min, 盡量去除殘留的上清。
注：本步驟可以充分去除殘留的轉(zhuǎn)化試劑溶液中的組分，避免轉(zhuǎn)化試劑溶液中的組分對于后續(xù)的不良影響。
2.7原生質(zhì)體重懸：
沉淀中加入1 ml 溶液V, 輕柔重懸。
2.8原生質(zhì)體培養(yǎng)：
將離心管水平放置，23-25℃弱光培養(yǎng)。
注：根據(jù)實驗需求確定孵育時間。RNA分析孵育2-6小時；酶活性分析和蛋白標記實驗孵育2-16小時；基因編輯的 效果在轉(zhuǎn)染24小時后可能被檢測到。
