● 產(chǎn)品組成：
| 組分貨號(hào) | 名稱(chēng) | 規(guī)格 | 貯存 | 運(yùn)輸 |
| PN5040-01 | 試劑1-NR誘導(dǎo)劑（50×） | 10 ml | 4℃ | RT |
| PN5040-02 | 試劑2-NR提取緩沖液（2×） | 25 ml | 4℃ | RT |
| PN5040-03 | 試劑3-NR分析緩沖液 | 25 ml | 4℃ | RT |
| PN5040-04 | 試劑4-NADH（10×） | 1.2 ml | -20℃ | RT |
| PN5040-05 | 試劑5-顯色液1 | 15 ml | 4℃ | RT |
| PN5040-06 | 試劑6-顯色液2 | 15 ml | 4℃ | RT |
| PN5040-07 | 試劑7-標(biāo)準(zhǔn)液（100×） | 1 ml | -20℃ | RT |
| DT0140P | 1M DTT | 1 ml | -20℃ | RT |
● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
硝酸還原酶（Nitrate Reductase，NR，EC1.7.1.3）廣泛存在于植物中，是植物硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮的關(guān)鍵酶，它的活性高低直接影響到植物對(duì)土壤中硝態(tài)氮素的利用，影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。硝酸還原酶是一種誘導(dǎo)酶，通常在有 NO3-存在時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)硝酸還原酶的活性。
測(cè)定原理：NR催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，NO3ˉ+NADH→ NO2ˉ +NAD＋+H2O；產(chǎn)生的亞硝酸鹽能夠在酸性條件下，與對(duì)–氨基苯磺酸α-萘胺定量生成紅色偶氮化合物； 生成的紅色偶氮化合物在 540 nm有最大吸收峰，可用分光光度法測(cè)定。
按照每次提取使用1 ml提取緩沖液計(jì)算，該產(chǎn)品可以使用45-50次。
● 貯存和效期：
試劑盒常溫運(yùn)輸；按照標(biāo)簽溫度貯存；開(kāi)封使用后有效期一年。
● 自備材料：
植物根莖、葉子等；剪刀；離心管；分光光度計(jì)；水浴鍋；離心機(jī)；1ml比色皿
● 操作步驟：
用前必讀：由于不同材料NR活性差距較大，首次實(shí)驗(yàn)時(shí)建議取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定。
準(zhǔn)備30度水浴；分光光度計(jì)調(diào)節(jié)到540nm，開(kāi)機(jī)預(yù)熱30分鐘。
一、 樣本處理：
1. 樣品的誘導(dǎo)前處理：
將NR誘導(dǎo)劑（50×）用蒸餾水稀釋50倍，如取49 ml蒸餾水加入1 ml 誘導(dǎo)劑。 將植物樣品浸泡于誘導(dǎo)劑中，浸泡2小時(shí)。
注：如未經(jīng)誘導(dǎo)，植物體內(nèi)NR活性很低，預(yù)測(cè)定結(jié)果沒(méi)有活性(OD測(cè)定管＜OD對(duì)照管)則需要誘導(dǎo)處理。
二、 硝酸還原酶提�。�
2. 即用型NR提取緩沖液配制：
|
| 一個(gè)反應(yīng)配制體積 1 ml | n個(gè)反應(yīng)配制體積 n×1 ml |
| 試劑2-NR提取緩沖液（2×） | 0.5 ml | n×0.5 ml |
| 1 M DTT（100×） | 10 μl | n×10 μl |
| 滅菌水 | 0.49 ml | n×0.49 ml |
注：配制好的即用型NR提取緩沖液可以4℃短期保存一周；
3. NR提取步驟
取誘導(dǎo)后的樣品或新鮮植物組織，清洗干凈，擦干，液氮中研磨，1 cm2葉片（1分硬幣大�。┗�0.1g葉片粉末加入1 ml 即用型NR提取緩沖液，顛倒混勻， 12000rpm4℃離心 5分鐘，上清即為NR提取液，冰浴放置備用。
注：NR提取液最好立即測(cè)定，不建議保存。
三、硝酸根還原步驟:
4. 即用型標(biāo)準(zhǔn)液配制：
取試劑7-標(biāo)準(zhǔn)液（100×）稀釋100倍，即取10 μl加990μl滅菌水中，混勻，即用型標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0.1 μmol/ml（100 μM）。
5. 即用型NADH配制：
根據(jù)標(biāo)簽所示加入超純水配制試劑4-NADH（10×），稀釋10倍，如取100 μl加900 μl滅菌水，混勻，冰浴備用。
6. 參考下表設(shè)置檢測(cè)反應(yīng)體系，按照順序在1.5ml離心管中依次加入試劑（單位μl）：
| 加入順序 |
| 1#測(cè)定管 | 2#對(duì)照管 | 3#標(biāo)準(zhǔn)管 | 4#空白管 |
| 1 | NR提取液（樣本） | 100 | 100 | - | - |
| 2 | 即用型標(biāo)準(zhǔn)液 0.1 μmol/ml(100 μM) | - | - | 100 | - |
| 3 | 蒸餾水 | - | 125 | - | 125 |
| 4 | 試劑3-NR分析緩沖液 | 375 | 375 | 375 | 375 |
| 5 | 即用型NADH | 125 | - | 125 | - |
| 6 |
| 30度水浴0.5小時(shí) | |||
| 7 | 試劑5-顯色液1 | 250 | 250 | 250 | 250 |
| 8 | 試劑6-顯色液2 | 250 | 250 | 250 | 250 |
| 9 |
| 混勻，常溫顯色0.5 小時(shí) | |||
四、計(jì)算：
7. 用蒸餾水調(diào)零分光光度計(jì)，取1ml加到比色皿中，分別測(cè)定各管在540nm的吸光值，記錄讀數(shù)。
NR單位定義（Units）：每小時(shí)每克鮮重樣品中催化產(chǎn)生1μmol NO2-的量為一個(gè)NR活力單位。
NR活性（μmol/h/g FW）=（測(cè)定OD-對(duì)照OD）/（標(biāo)準(zhǔn)OD-空白OD）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（0.1 μmol/ml）×（取樣體積0.1 ml）/（樣品鮮重g×反應(yīng)時(shí)間0.5 h）×樣品測(cè)定前稀釋倍數(shù)（如0.1g葉片用1ml提取緩沖液，即稀釋10倍）
此公式整理為：NR活性（μmol/h/g FW）=0.2/FW×（測(cè)定OD-對(duì)照OD）/（標(biāo)準(zhǔn)OD-空白OD）
8. 計(jì)算舉例：
0.1克植物鮮重材料使用1 ml提取緩沖液提取：稀釋倍數(shù)為10
測(cè)定OD=0.159 對(duì)照OD=0.121 標(biāo)準(zhǔn)OD=0.16 空白OD=0.004
NR 活性（μmol/h/g FW）=0.2/0.1×（0.159-0.121）/（0.16-0.004）=0.012
