總超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒
(NBT核黃素比色法)
一、產(chǎn)品簡介：
超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase, SOD)是含金屬輔基的酶，能催化超氧化物陰 離子發(fā)生岐化作用， 生成過氧化氫(H2O2)和氧氣(O2)，是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶； 由于超氧自由基是不穩(wěn)定的的自由基， 壽命極短，SOD 活性一般用間接方法測定，并利用各種呈色反應(yīng)來測定 SOD 活力，其中顯色劑有 NBT(唑藍(lán)四氮)、WST-1、WST-8 等。
雅吉生物總超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(NBT 核黃素比色法)(Total Superoxide Dismutase Assay Kit with NBT)是一種基于 NBT 的光還原反應(yīng)，所以又稱作 NBT 光還原 法， 檢測原理是在有氧化物質(zhì)存在下核黃素被光還原， 在有氧條件下， 被還原的核黃素極易 再氧化產(chǎn)生超氧陰離子自由基(O2.-) ，O2.-可將氮藍(lán)四唑還原為藍(lán)色的甲腙，后者在560nm處有強(qiáng)吸收，而 SOD 可清除超氧陰離子(O2.-)，從而抑制了甲腙的形成。于是光還原反應(yīng)后， 反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說明SOD活性愈低， 反之酶活性愈高，據(jù)此通過可見分光光度計(jì)比色分 析就可以計(jì)算出樣品中總超氧化物岐化酶活性水平。本方法是利用SOD抑制NBT在光照下的還原作用來確定酶活性大小，可用于檢測植物、組織、細(xì)胞、血清或其它樣品中SOD活性。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。。
該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。
二、產(chǎn)品組成：
| 名稱 | 50T | 100T | Storage |
| 試劑(A): SOD提取液 | 250ml | 2×250ml | RT |
| 試劑(B): Met緩沖液 | 100ml | 2×100ml | 4℃避光 |
| 試劑(C): NBT溶液 | 15ml | 30ml | 4℃避光 |
| 試劑(D): FD溶液 | 15ml | 30ml | 4℃避光 |
三、自備材料：
1、 生理鹽水或 PBS
2、 電子天平、剪刀、低溫冰箱或制冰機(jī)、冰袋、勻漿器或研缽、離心機(jī)、離心管、小試管、 光照培養(yǎng)箱光源或 40W 熒光燈或日光燈、測光儀(照度計(jì))、分光光度計(jì)、比色杯
四、操作步驟(僅供參考)：
1、 準(zhǔn)備樣品：
①血漿或含紅細(xì)胞的樣品：從待測樣品中分理出的血清或血漿不應(yīng)有溶血，如果含有應(yīng)去除紅細(xì)胞后檢測，如超過檢測范圍，用SOD提取液稀釋后檢測。血清去除紅細(xì)胞的簡易方法如下：用抗凝管收集血液，顛倒混勻，取至少500μl全血，4℃ 3000g離心5min，轉(zhuǎn)移上清至另一新的1ml離心管中，適量生理鹽水稀釋后待測；亦可采用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，如 ACK紅細(xì)胞裂解液等。
②組織樣品：動(dòng)物用含有20U/ml Heparin的生理鹽水(0.9% NaCl containing 20U/ml Heparin)灌流清除血液后獲取組織樣品。按照每100mg組織加入500μl SOD提取液的比例，用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿，4℃ 4000g離心10min，取上清液(SOD粗提液)用于酶活性的測定。
③細(xì)胞樣品：對(duì)于貼壁細(xì)胞，由于后續(xù)用于酶活性的測定，避免使用胰酶消化細(xì)胞。可以使用細(xì)胞刮或EDTA處理細(xì)胞并收集細(xì)胞，細(xì)胞用無菌的PBS或生理鹽水洗滌1次，按照每106細(xì)胞加入300～500μl SOD提取液的比例，用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿，4℃ 10000g離心10min，取上清液(SOD粗提液)用于酶活性的測定。
④植物樣品：準(zhǔn)確稱取植物材料(果肉或者去葉脈的葉片)0.4g，剪碎，置于4℃預(yù)冷的研缽或勻漿器中，加入預(yù)冷提取液1ml，低溫研磨至勻漿后轉(zhuǎn)移至離心管，用3ml提取液沖洗研缽或勻漿器并轉(zhuǎn)入離心管，加提取液至總體積為4ml，4℃ 10000r/min離心20min，上清液為酶提取液，上清液可用于SOD的檢測。注意：如果SOD酶活性較低，應(yīng)相應(yīng)減少提取液的總體積，以便提高SOD酶的濃度。
⑤上述樣品準(zhǔn)備完畢后可以BCA蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白濃度，通常10-20μg蛋白的細(xì)胞或組織勻漿液樣品其中的SOD平均活力約1個(gè)活力單位左右(不同細(xì)胞和組織的差異會(huì)比較大，該活力范圍僅作為初步的參考)；每種樣品準(zhǔn)備20～100μg蛋白量通常已經(jīng)足夠用于后續(xù)檢測，根據(jù)蛋白濃度和預(yù)計(jì)的蛋白使用量，用該試劑盒提供的SOD提取液適當(dāng)稀釋樣品，例如小鼠肝臟組織10%勻漿液(組織和勻漿液的重量比為10%)上清，通常需要稀釋10～100倍，準(zhǔn)備好的樣品如果當(dāng)天測定，可以冰浴保存；如果當(dāng)天不能完成測定，可以-20℃凍存，但建議盡量當(dāng)天完成測定。
2、 (選做)準(zhǔn)備SOD標(biāo)準(zhǔn)品：需自備SOD標(biāo)準(zhǔn)品，用本試劑盒提供的SOD提取試劑將SOD 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至如下系列濃度： 200、100、50、20、10、5、2U/ml，各取20μl參考樣 品進(jìn)行檢測。
注意：為避免稀釋后SOD酶活性的下降，SOD 標(biāo)準(zhǔn)品宜現(xiàn)稀釋現(xiàn)使用 ，該試劑盒對(duì)于 SOD的檢測并不需要SOD作為標(biāo)準(zhǔn)品， 但可使用SOD標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對(duì)照或作為對(duì) SOD 活性定量的參考。
3、 選取合適的光源：在光照培養(yǎng)箱或日光燈下， 用光度儀測定光度值為 3500~4000Lx 的
適合光照反應(yīng)的位置，做出標(biāo)記。
4、配制NBT工作液：將 Met緩沖液與NBT溶液按 23:3 的比例混合即可。
5、SOD加樣：參考下表使用96孔板設(shè)置空白對(duì)照孔、光照對(duì)照孔、測定孔， 在低光強(qiáng)條件下按下表依次加入待測樣品和其它各種溶液， 加入 FD 溶液后充分混勻。
注意：加入FD 溶液后反應(yīng)即會(huì)開始，在低光強(qiáng)條件下用排槍操作可減小各孔間因加入試劑的時(shí)間先后差異而導(dǎo)致的誤差。
| 加入物(ml) | 空白對(duì)照孔 | 光照對(duì)照孔 | 測定孔 |
| SOD 提取試劑 | 0.08 | 0.08 |
|
| 待測樣品(上清液) | — | — | 0.08 |
| NBT 工作液 | 2.08 | 2.08 | 2.08 |
| FD 溶液 | 0.24 | 0.24 | 0.24 |
6、 SOD 測定：混勻，取空白對(duì)照孔置于暗處， 其他各孔置于 4000Lx 日光下反應(yīng) 20min， 各孔受光情況應(yīng)一致， 溫度高時(shí)時(shí)間可縮短， 低時(shí)延長； 反應(yīng)結(jié)束后，以不照光的空白對(duì)照孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀測定 560nm 處吸光度。
五、計(jì)算結(jié)果：
SOD活力單位定義：以抑制NBT光化還原的50%為一個(gè)酶活性單位(U)。
液體中總SOD活力(U/ml)=(A光照－A測定)/(50%×A光照×VT)
組織、細(xì)胞勻漿液中總SOD活力(U/g)=(A光照－A測定)×V/(50%×A光照×VT×W)
血液中總SOD活力(U/gHb)=(A光照－A測定)×V×C/(50%×A光照×VT×Hb)
式中：A光照=光照對(duì)照管的吸光度
A測定=測定管的吸光度
V=樣品液總體積(ml)
VT=測定時(shí)樣品所用體積(ml)
W=樣品鮮質(zhì)量(g)
C=1ml/采血量(ml)
Hb=血紅蛋白含量(gHb/ml)
六、注意事項(xiàng):
1、 上述低溫試劑避免反復(fù)凍融，以免失效或效率下降。待測樣品-70℃可保存 1 個(gè)月，需 注意反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致 SOD 部分失活。
2、 植物中的多酚類物質(zhì)會(huì)引起酶蛋白不可逆沉淀，使酶失去活性，因此在提取 SOD 酶時(shí)， 必須添加多酚類物質(zhì)的吸附劑， 將多酚物質(zhì)除去， 避免酶蛋白變性失活。SOD 提取試 劑含有 PVP 等成分， 可有效去除多酚類物質(zhì)。 SOD 提取試劑不夠用可以用磷酸鈉緩沖
液(0.05M,pH7.8)替代。
3、 細(xì)胞或組織等樣品制備時(shí)，不能采用含有 Triton X-100 等去垢劑的溶液，否則會(huì)干擾 本試劑盒的檢測。
4、 抗氧化物會(huì)對(duì)本試劑盒的檢測產(chǎn)生干擾，例如 0.1mM ascorbic acid ，5mM GSH 都 會(huì)使測定出來的吸光度顯著升高。
5、 對(duì)于植物樣品， 研磨處理應(yīng)迅速，以免 SOD 酶活下降，盡量在冰浴條件下處理。
6、 如果用酶標(biāo)儀， 96 孔板每孔加入的各試劑量應(yīng)相應(yīng)按比例減少，相應(yīng)檢測的次數(shù)大大 增加。
7、 所用離心管或 96 孔板應(yīng)潔凈透明， 透光性好。
8、 一般要求各孔受光情況一致，所有反應(yīng)管應(yīng)排列在與日光燈燈管平行的直線上。
9、 反應(yīng)溫度控制在 25℃,視酶活性高低適當(dāng)調(diào)整反應(yīng)時(shí)間； 溫度較高時(shí)， 光照時(shí)間應(yīng)縮 短；溫度較低時(shí)，光照時(shí)間相應(yīng)延長。
10、 如果無 4000Lx 日光， 可 200W 在 10~12cm 處 ，照射 20min；超凈工作臺(tái) 5cm 處 光強(qiáng)約 800~1000Lx ，,照射 30~40min；強(qiáng)太陽光下一般光強(qiáng)可達(dá) 30000Lx ，照射 5~15min ，一般不建議直接用太陽光。
11、 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
七、有效期∶6個(gè)月有效。
