注 意：正式測(cè)定前務(wù)必取 3 - 5 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
測(cè)定對(duì)象中各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構(gòu)成總抗氧化水平。在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和藥學(xué)研究中常常檢測(cè)血漿、血清、唾液、尿液等各種體液，細(xì)胞或組織等裂解液、植物或中草藥抽提液及各種抗氧化物(antioxidant)溶液的總抗氧化能力。
測(cè)定原理：
在酸性環(huán)境下，抗氧化物質(zhì)還原 Fe3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)產(chǎn)生藍(lán)色的 Fe2+-TPTZ 的能力反映了總抗氧化能力。
自備實(shí)驗(yàn)用品：
恒溫水浴鍋、低溫離心機(jī)、酶標(biāo)儀、96 孔板和蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：液體 120mL×1 瓶，使用前預(yù)冷。
試劑一：液體 20 mL×1 瓶，避光保存。
試劑二：液體 2 mL×1 瓶，4℃避光保存。
試劑三：液體 2 mL×1 瓶，避光保存
樣品的制備：
(1)血清、血漿、唾液或尿液等液體樣品
血漿（制備時(shí)可以使用肝素或檸檬酸鈉抗凝，不宜使用 EDTA 抗凝）4℃，5000rpm 離心10min，取上清待測(cè)。血清、唾液或尿液樣品直接用于測(cè)定，也可以-80℃凍存（不宜超過(guò)30 d）后再測(cè)定。
(2)組織樣品
按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后離心 10min（10,000g離心力，4℃），取上清，置冰上待測(cè)。
(3)細(xì)胞樣品
按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入1mL 提取液），冰浴超聲波破碎（功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；離心 10min（10,000g離心力，4℃），取上清，置冰上待測(cè)。
操作步驟：
1、 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 593nm。
2、 混合液：根據(jù)使用量，將試劑一、試劑二、試劑三按 10:1:1 的比例混合，現(xiàn)用現(xiàn)配，使用前 37℃ 預(yù)熱。
3、 操作表
| 試劑名稱(chēng)（μL） | 測(cè)定管 | 空白管 （只做一管） |
| 樣品 | 10 |
|
| 提取液 |
| 10 |
| 混合液 | 190 | 190 |
| 充分混勻，反應(yīng) 20min，于 96 孔板，測(cè)定 593nm 吸光值， △A= A 測(cè)定-A 空白 | ||
注意：若測(cè)定管吸光值大于 1.5 則需要用提取液稀釋?zhuān)ㄓ?jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)）。
總抗氧化能力計(jì)算公式：
標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y = 1.2416x + 0.0134R2 = 0.9996
x:Trolox 濃度(μmol/mL) y:吸光值差值△A
單位定義:用從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上獲得的抗氧化劑 Trolox 的量來(lái)表示樣本的總抗氧化能力。
（1）按樣本質(zhì)量計(jì)算
總抗氧化能力（μmol Trolox/g 鮮重）=（△A-0.0134）÷1.2416×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×W)
=0.8054×（△A-0.0134）÷W
（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算
總抗氧化能力（μmol Trolox/mg prot）=（△A-0.0134）÷1.2416×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×Cpr)
=0.8054×（△A-0.0134）÷Cpr
（3）按細(xì)胞計(jì)算
總抗氧化能力（μmol Trolox/104cell）=（△A-0.0134）÷1.2416×V 樣÷（V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)））
= 0.8054×（△A-0.0134）÷ 細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）
（4）按液體體積計(jì)算
總抗氧化能力（μmol Trolox/mL）=（△A-0.0134）÷1.2416
=0.8054×（△A-0.0134）
V 樣總：加入提取液體積，1 mL；
V 樣：反應(yīng)中樣品體積，10μL；
W：樣品質(zhì)量，g；
Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL
注意事項(xiàng)：
1.試劑二對(duì)人體有刺激性，請(qǐng)采取適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)措施。為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴乳膠手套操作。
2.盡量避免使用在酸性條件下呈藍(lán)色或接近藍(lán)色的試劑，否則對(duì)本試劑盒的檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生干擾。
3.樣品中不宜添加Tween、Triton 和 NP-40 等去垢劑和DTT、巰基乙醇等影響氧化還原反應(yīng)的還原劑。
