NADH-輔酶Q 還原酶說明書，比色法
一、反應(yīng)原理
線粒體呼吸鏈復(fù)合物I通常稱為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶Q還原酶
（reduced nicotinamide adenine dinucleotide coenzyme Q reductase, NADH-CoQ
reductase），又稱為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶（reduced nicotinamide adenine
dinucleotide dehydrogenase；NADH dehydrogenase），是線粒體電子傳遞鏈中最大的結(jié)構(gòu)
成分：含有30至40多個(gè)多肽結(jié)構(gòu)。其特征性的酶活性是魚藤酮敏感的NADH－輔酶Q還
原酶（NADH:Q Reductase）。復(fù)合物I催化線粒體內(nèi)電子由供體NADH傳遞到內(nèi)膜上輔酶
Q受體（泛醌；ubiquinone）的能量轉(zhuǎn)移反應(yīng)，為整個(gè)呼吸鏈反應(yīng)系統(tǒng)的第一步。基于
輔酶Q底物，在魚藤酮存在與否的情況下，通過NADH－輔酶Q還原酶的催化，轉(zhuǎn)化成
還原型泛醌（CoQH2），同時(shí)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine
dinucleotide；NADH）轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine
dinucleotide；NAD），在分光光度儀下產(chǎn)生吸收峰值的變化（340nm 波長(zhǎng)），由此定量
測(cè)定NADH－輔酶Q還原酶的特異活性。其反應(yīng)系統(tǒng)是：
NADH:Q Reductase NADH + H
＋ + CoQ → NAD
－ + CoQH2 二、試劑組成：（20 管/10 樣)）
緩沖液（Reagent A）
反應(yīng)液（Reagent B）
陰性液（Reagent C）
底物液（Reagent D）
專性液（Reagent E）
產(chǎn)品說明書
20 毫升
2.5 毫升
2 毫升
500 微升
200 微升
1 份
三、保存方式
-20℃冰箱保存，避免反復(fù)凍融；反應(yīng)液（Reagent B）含有毒性物質(zhì)，避免直接用
手接觸；反應(yīng)液（Reagent B）和底物液（Reagent D），避免光照，有效保證6月
四、用戶自備
比色皿：用于比色分析的容器
雙波長(zhǎng)分光光度儀：用于比色分析
培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)物
五、實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；緩沖液
（Reagent A）室溫預(yù)熱；反應(yīng)液（Reagent B）和底物液（Reagent D）注意避光。然
后進(jìn)行下列操作。
（一）、背景對(duì)照測(cè)定
1、移取 780 微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
2、加入 100 微升反應(yīng)液（Reagent B）
3、加入 20 微升底物液（Reagent D）
4、放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里靜置 3 分鐘
5、加入 100 微升陰性液（Reagent C）
6、上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）
7、即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：
（340 波長(zhǎng)讀數(shù)－380 波長(zhǎng)讀數(shù)）0 分鐘－（340 波長(zhǎng)讀數(shù)－380 波長(zhǎng)讀數(shù)）1 分鐘或 3 分鐘
（二）、樣品總活性測(cè)定
1、移取 780 微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
2、加入 100 微升反應(yīng)液（Reagent B）
3、加入 20 微升底物液（Reagent D）
4、放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里靜置 3 分鐘
5、加入 100 微升待測(cè)樣品（注意：10 微克總線粒體蛋白）
6、上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）
7、即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品總活性讀數(shù)：
（340 波長(zhǎng)讀數(shù)－380 波長(zhǎng)讀數(shù)）0 分鐘－（340 波長(zhǎng)讀數(shù)－380 波長(zhǎng)讀數(shù)）1 分鐘或 3 分鐘
（三）、樣品非特異活性測(cè)定
1、移取 760 微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
2、加入 100 微升反應(yīng)液（Reagent B）
3、加入 20 微升專性液（Reagent E）
4、加入 20 微升底物液（Reagent D）
5、放進(jìn) 30℃培養(yǎng)箱里靜置 3 分鐘
6、加入 100 微升待測(cè)樣品（注意：10 微克總線粒體蛋白）
7、上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在 3 秒之內(nèi)）
8、即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品非特異活性讀數(shù)：
（340 波長(zhǎng)讀數(shù)－380 波長(zhǎng)讀數(shù)）0 分鐘－（340 波長(zhǎng)讀數(shù)－380 波長(zhǎng)讀數(shù)）1 分鐘或 3 分鐘
六、樣品活性計(jì)算
（1） 、樣品活性（總活性或非特異活性）
（樣本讀數(shù) - 背景讀數(shù)）×體系容量（1ml）×樣本稀釋倍數(shù) 樣本蛋白濃度 ÷
樣本容量（0.1ml）×5.5（毫摩爾吸光系數(shù)）×反應(yīng)時(shí)間（1或者3分鐘）
單位：μmol NADH/min/mgprot
（2） 、樣品特異活性
樣品總活性－樣品非特異活性＝樣品特異活性
（mgprot/ml）
（蛋白濃度可通過用 總蛋白定量考馬斯亮藍(lán)法試劑盒測(cè)定）
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