該試劑盒低濃度檢測能力一般，建議客戶 控制樣本濃度在 500ug/ mL 以上

我司用的標(biāo)準(zhǔn)物 D-谷氨酰胺 【CAS：5959-95-5 】【僅供參考】

600ug/mL 水溶

測定管吸光度：0.149

對照管吸光度：0.105

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

谷氨酰胺（Glutamine）是構(gòu)成人體蛋白質(zhì)所必需的20種氨基酸之一。是人體內(nèi)最普遍的、不可缺乏的條件性必需氨基酸，是構(gòu)成蛋白質(zhì)不可缺少的氨基酸之一，更是某些細(xì)胞培養(yǎng)中最基本的元素。由于谷氨酰胺不穩(wěn)定的特性，在細(xì)胞培養(yǎng)基的整合中，易自發(fā)性分解為谷氨酸和氨離子，而氨離子對細(xì)胞的毒性很強(qiáng)，因此，在細(xì)胞培養(yǎng)體系中，須密切關(guān)注谷氨酰胺的儲存壽命（SHELF LIFE）和實(shí)時監(jiān)測。

測定原理：

在谷氨酰胺酶（Glutaminase）作用下，谷氨酰胺發(fā)生脫氨基反應(yīng)，產(chǎn)生谷氨酸（glutamic acid）和氨離子；

谷氨酰胺+H₂O———————谷氨酸+NH₄⁺

然后用顯色劑進(jìn)行顯色，顯色后在570nm下進(jìn)行測定。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL玻璃比色皿、研缽、冰、蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：液體50mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：液體1.5ml×1瓶，-20℃保存；

試劑三，粉劑×1瓶， 4℃保存；臨用前加入10mL蒸餾水，充分混勻溶解，用不完的試劑仍 4℃保存

谷氨酰胺提�。�

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞樣品：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議1000萬細(xì)菌或細(xì)胞加入2mL試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 常溫離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織樣品：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.2g組織，加入2mL試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 常溫離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）或細(xì)胞培養(yǎng)液樣品：按照血清（漿）或細(xì)胞培養(yǎng)液體積（mL）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議取0.2mL血清（漿）或者細(xì)胞培養(yǎng)液加入2mL試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 常溫離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至570nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 在有蓋EP管中加入下列試劑：

混勻，37℃水浴30min（蓋緊，以防止水分散失），

90℃水浴20min（蓋緊，以防止水分散失），流水冷卻，于570nm波長處比色，
△A=A測定管 - A對照管1 - A對照管2。對照管2只要做一管。

 谷氨酰胺含量計(jì)算：

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測定回歸方程為y = 0.0074x- 0.5255；x為谷氨酰胺含量（µg/mL），y為吸光值。

2、按照血清（漿）或者細(xì)胞培養(yǎng)液體積計(jì)算

谷氨酰胺含量(μg/mL)= [(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(V3×V1÷V2）=1351×(△A+0.5255)

3、按照蛋白濃度計(jì)算

谷氨酰胺含量(µg/mg prot)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(V1×Cpr)=135.1×(△A+0.5255) ÷Cpr

4、按照樣本質(zhì)量計(jì)算

谷氨酰胺含量(µg/g鮮重)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(W ×V1÷V2)=270.2×(△A+0.5255) ÷W

5、按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

谷氨酰胺含量(μg/10⁴ cell)=[(△A +0.5255)÷0.0074×V1]÷(1000×V1÷V2)=0.27×(△A+0.5255)

V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，1mL；V2：加入提取液體積，2 mL；V3：加入血清（漿）或細(xì)胞培養(yǎng)液體積，0.2 mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；1000：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，1000萬。

注意：

1、該試劑盒僅適用于發(fā)酵液或組織中谷氨酰胺含量測定，檢測下限為100µg/mL。

2、標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為：100µg/mL -600µg/mL。

3、ΔA線性范圍為：0.01-2；若大于2則需要將上清液用試劑一稀釋至適當(dāng)倍數(shù)后測定，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。