- 介紹： 基 因 型endA1 sbcBC recBC galK met thi-1 bioT hsdR (Strr)簡(jiǎn) 要 說 明BJ5183是一種具有較高重組活力的大腸桿菌菌株，是目前腺病毒系統(tǒng)最常用的感受態(tài)細(xì)胞。BJ5183菌株含有sbcBC recBC雙重突變，賦予BJ5183細(xì)胞較強(qiáng)的重組能力，有利于轉(zhuǎn)入的目的基因與腺病毒質(zhì)粒{pAdeasy-1[encodes the Adenovirus-5 genome (E1/E3 deleted)]或pAdeasy-2[encodes the Adenovirus-5 genome (E1/E3/E4 deleted)]}的重組。endA1（缺失核酸內(nèi)切酶）的突變有利于重組DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取。Strr 賦予BJ5183菌株鏈霉素抗性。BJ5183感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率>5×108 cfu/μg DNA。
- 操 作 說 明
- 1.BJ5183感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的質(zhì)粒（含有目標(biāo)基因并線性化）和腺病毒質(zhì)粒，并用手撥打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。
- 2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰中并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。
- 3.向離心管中加入700 μl不含抗生素的無菌培養(yǎng)基 (2YT或LB)，混勻后37℃，200 rpm復(fù)蘇60分鐘。
- 4.5000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。
- 5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。
- 注 意 事 項(xiàng)
- 1.感受態(tài)細(xì)胞最好在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時(shí)間過長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間存放會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。
- 2.混入目的DNA時(shí)應(yīng)輕柔操作。
- 3.BJ5183菌株的質(zhì)粒產(chǎn)量不高。腺病毒構(gòu)建成功后，可選擇在其他大腸桿菌菌株中擴(kuò)繁，純化質(zhì)粒。
- 4.BJ5183感受態(tài)細(xì)胞對(duì)溫度敏感，應(yīng)儲(chǔ)存在-80℃超低溫冰箱，避免溫度波動(dòng)，溫度波動(dòng)會(huì)降低感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率。
- 儲(chǔ)存條件： -80℃
- 用途： 克隆感受態(tài)細(xì)胞
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