病毒RNA抽提試劑盒(離心柱式)
產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
離心柱式病毒RNA抽提試劑盒( Viral RNA Isolation Kit with Spin Column)是一種基于離心柱 法從含病毒的血漿、血清、體液、拭子及細(xì)胞及其培養(yǎng)上清、組織等樣品中安全、快速、便捷、穩(wěn)定、高效、高質(zhì)量地抽提長(zhǎng)度 大于200個(gè)核苷酸(nucleotide, nt)的病毒RNA的試劑盒。抽提獲得的大于200個(gè)核苷酸的病毒RNA樣品(可能同時(shí)含有樣品中的其 它RNA)可以用于各種常規(guī)用途。
本試劑盒抽提得到的病毒RNA可用于qRT-PCR、反轉(zhuǎn)錄、RT-PCR、qPCR、Northern、點(diǎn)雜交(Dot Blot)、純化mRNA、體外 翻譯、RNase protection assay、cDNA克隆等下游實(shí)驗(yàn)；也可用于基因表達(dá)芯片分析(microarray)、高通量測(cè)序(high throughput sequencing)等對(duì)RNA質(zhì)量要求較高的情況。
本試劑盒抽提病毒RNA的基本流程如圖1所示。樣品在裂解液中迅速裂解，釋放出總RNA，然后讓RNA特異性地結(jié)合到純化柱上， 而蛋白質(zhì)等其它組分通過(guò)高速離心被有效去除，再通過(guò)3次洗滌充分去除非特異性結(jié)合的蛋白、鹽等雜質(zhì)，最后用洗脫液將高純度 的RNA洗脫下來(lái)。
本試劑盒使用安全。本試劑盒通過(guò)特殊的柱純化介質(zhì)進(jìn)行病毒RNA分離純化， 能有效避免傳統(tǒng)的Trizol法抽提時(shí)使用的酚、氯仿 等有毒有害有機(jī)試劑。
本試劑盒使用快速、便捷。本試劑盒采用柱純化，無(wú)需繁瑣的病毒RNA沉淀步驟，抽提操作過(guò)程僅15-20分鐘。相比于傳統(tǒng)的Trizol 抽提法，本試劑盒的操作流程顯著簡(jiǎn)化， 縮短了抽提時(shí)間， 降低了病毒RNA被降解的風(fēng)險(xiǎn)。和國(guó)外同類柱純化產(chǎn)品相比，所需操 作步驟和操作時(shí)間基本一致。
本試劑盒適用于含病毒的血漿、血清、體液、拭子及細(xì)胞及其培養(yǎng)上清、組織等樣品中病毒RNA的抽提，為提高病毒RNA的提取 量，建議自備carrier RNA。Carrier RNA一方面可以提高微量病毒RNA在純化過(guò)程中與純化柱的結(jié)合效率和洗脫效率；另一方面 可以降低被可能存在的痕量殘留RNase降解的風(fēng)險(xiǎn)。Carrier RNA在病毒含量較少的情況下效果更為明顯。Carrier RNA推薦購(gòu) 買我司的R0036 Carrier RNA (病毒RNA等抽提用)
本試劑盒小包裝R0035S可用于12個(gè)樣品的RNA抽提，中包裝YS0035S可用于50個(gè)樣品的RNA抽提，大包裝R0035L可用于200個(gè) 樣品的RNA抽提。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| YS0035S-1 | 裂解液 | 32ml |
| YS0035S-2 | 結(jié)合液 | 32ml |
| YS0035S-3 | 洗滌液I | 32ml |
| YS0035S-4 | 洗滌液II | 63ml |
| YS0035S-5 | 洗脫液 | 5ml |
| YS0035S-6 | RNA純化柱及廢液收集管 | 50套 |
| YS0035S-7 | RNA洗脫管 | 50個(gè) |
| — | 說(shuō)明書 | 1份 |
保存條件：室溫保存， 一年有效
注意事項(xiàng)：
如果樣品中含有細(xì)胞或組織，不影響病毒RNA的抽提，但須注意抽提獲得的病毒RNA中包含細(xì)胞或組織的RNA。
為提高病毒RNA的提取量，推薦使用我司的Carrier RNA (病毒RNA等抽提用) (R0036)或自備carrier RNA。
本試劑盒提供的所有試劑和耗材都是RNase-free，操作時(shí)應(yīng)小心，避免被污染。所有自行準(zhǔn)備的試劑和耗材也都應(yīng)是RNase-free。 如果可能有RNase污染，可考慮用0.01%的DEPC水浸泡過(guò)夜，然后高溫高壓滅菌并烘干。操作時(shí)應(yīng)避免對(duì)著樣品或所使用的試劑 盒耗材呼氣或說(shuō)話，以防RNase污染。建議戴一次性口罩操作。
對(duì)于操作環(huán)境中RNA酶的去除，推薦使用我司生產(chǎn)的RNase and DNase Away (R0123)以去除實(shí)驗(yàn)桌面上或其它接觸面上的 RNase。
使用凍存的樣品抽提RNA的效果通常比新鮮的樣品差一些。因?yàn)樵跇悠穬鋈谶^(guò)程中一些RNase會(huì)被釋放出來(lái)并消化樣品中的 RNA，建議盡量避免凍融。對(duì)于病毒樣品， 推薦使用我司生產(chǎn)的RNALater™病毒RNA穩(wěn)定保存液(R0141)進(jìn)行保存以保證樣品 RNA的完整性。
本試劑盒所有操作均在室溫進(jìn)行，操作時(shí)無(wú)需冰浴。所有離心也均在室溫進(jìn)行。
廢液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丟棄。
結(jié)合液、洗滌液中含有乙醇，使用后須旋緊瓶蓋以防揮發(fā)，并須按照易燃試劑的相關(guān)規(guī)范進(jìn)行存放和使用。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。 使用說(shuō)明：
1. 樣品的準(zhǔn)備。
a. 液體樣品的準(zhǔn)備。
含病毒的血漿、血清、無(wú)細(xì)胞體液、拭子、細(xì)胞培養(yǎng)上清等樣品，按照常規(guī)方法取樣。每100µl液體樣品加入300µl裂解液。輕 輕顛倒混勻3-5次。
選做：為提高病毒RNA的提取量，建議在不含或含很少細(xì)胞或者組織的樣品中加入carrier RNA。推薦使用我司的R0036 Carrier RNA (病毒RNA等抽提用)，或使用下面方法提�。喝∪我庑迈r的細(xì)胞或組織，用抽提試劑盒(推薦R0024/R0026/R0027 動(dòng)物RNA抽提試劑盒(離心柱式))或Trizol法提取RNA (R0011、R0016)，作為carrier RNA。每個(gè)病毒樣品需要 2-5µg carrier RNA， 直接添加至裂解液中即可。
b. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備。
收集50-100萬(wàn)左右?guī)в胁《镜募?xì)胞。對(duì)于懸浮細(xì)胞， 1000-2000×g離心1分鐘后棄上清，加入300μl裂解液，輕輕吹打8-10次至 固懸物溶解、溶液澄清；對(duì)于貼壁細(xì)胞， 吸凈培養(yǎng)液后加入300μl裂解液，輕輕吹打5-10次至固懸物溶解、溶液澄清， 轉(zhuǎn)移至 一潔凈離心管內(nèi)。
c. 組織樣品的準(zhǔn)備。
取15-20mg帶有病毒的動(dòng)物組織，置于液氮中研磨成粉末，立即加入600μl裂解液。也可將組織置于1.5ml離心管中，迅速加入 600μl冰浴預(yù)冷的裂解液，用微型電動(dòng)勻漿器勻漿，或者用普通玻璃勻漿器進(jìn)行勻漿。研磨或勻漿后， 輕輕吹打勻漿液8-10次， 室溫放置3-5分鐘。然后約14,000×g離心2分鐘，將上清液移至新的離心管中。對(duì)于比較容易裂解且勻漿很充分的組織(如肝組 織、腦組織等)可以不用高速離心而直接進(jìn)入步驟2。
注意：細(xì)胞的數(shù)量一般不超過(guò)500萬(wàn)，不超過(guò)100萬(wàn)細(xì)胞宜使用300μl裂解液，多于100萬(wàn)細(xì)胞宜使用600μl裂解液。動(dòng)物組織的用 量一般不超過(guò)30mg，用量過(guò)多可能會(huì)因裂解不充分導(dǎo)致得率下降。組織樣品在裂解和離心后， 離心管下部可能會(huì)有一些膠狀物質(zhì)， 宜作為上清轉(zhuǎn)移至下一步操作。如果棄除膠狀物， 會(huì)導(dǎo)致得率下降約30-50%。后續(xù)加入結(jié)合液后膠狀物會(huì)消失。離心是為了去除 未勻漿充分的明顯塊狀物。如果裂解后仍有粘稠物，需增加吹打次數(shù)至溶液完全澄清。對(duì)于富含RNase的樣品， 裂解液中宜添加 DTT至終濃度為40mM或添加β-巰基乙醇至終濃度為1%。
2. 加入等體積(指病毒樣品和裂解液的總體積)結(jié)合液至裂解液中，輕輕顛倒混勻3-5次。此時(shí)可能會(huì)有沉淀物產(chǎn)生，屬于正常現(xiàn)象。
3. 將混合物(包括沉淀物)轉(zhuǎn)移至純化柱內(nèi)， 12,000×g離心30秒，倒棄收集管內(nèi)液體。
注意：當(dāng)裂解液的體積大于300µl時(shí)， 在加入等體積結(jié)合液后，總體積會(huì)超過(guò)純化柱的容量，這時(shí)應(yīng)分成2次過(guò)柱，即將一半的混 合物過(guò)柱后，再將剩余的混合物重復(fù)步驟3一次。對(duì)于一些特殊的樣品，如出現(xiàn)溶液未完全通過(guò)時(shí)， 可延長(zhǎng)離心時(shí)間至1-2分鐘， 或者加大離心力至16,000×g。對(duì)于一些能快速啟動(dòng)達(dá)到12,000×g的離心機(jī)，離心30秒已經(jīng)足夠，對(duì)于一些啟動(dòng)速度緩慢的離心 機(jī)本步驟及后續(xù)步驟中的30秒離心宜調(diào)整為60秒。
4. 加入600µl洗滌液I， 12,000×g離心30秒，倒棄收集管內(nèi)液體。
5. 加入600µl洗滌液II， 12,000×g離心30秒，倒棄收集管內(nèi)液體。
6. 重復(fù)步驟5一次。
7. 最高速(約14,000-16,000×g)離心2分鐘，去除殘留的液體。
8. 將RNA純化柱置于本試劑盒提供的RNA洗脫管中，加入30-50µl洗脫液，室溫放置2-3分鐘，最高速離心30秒，所得溶液即為純
化的病毒RNA樣品。樣品病毒RNA提取量可能會(huì)較少， 用紫外分光光度計(jì)較難測(cè)出，建議用qRT-PCR法檢測(cè)(推薦使用我司生產(chǎn)的D7277 BeyoFast™ Probe One-Step qPCR Mix或者D7268 BeyoFast™ SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit)。不同數(shù)量的 新冠病毒N基因慢病毒保存在含咽拭子的病毒樣品常規(guī)保存液(R0143)中，用本試劑盒提取病毒后使用新型冠狀病毒(2019-nCoV) 雙熒光qRT-PCR試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，此處的病毒量為每個(gè)PCR反應(yīng)體系中病毒的IU數(shù)。
| Amount ofvirus (IU/Reaction) | 400 | 40 | 4 | |
|
Ct Value | Replicate 1 | 24.58 | 27.93 | 32.19 |
| Replicate 2 | 25.07 | 28.27 | 31.58 | |
| Replicate 3 | 25.21 | 28.05 | 31.73 | |
| Average | 24.95 | 28.09 | 31.84 | |
注意：洗脫液需要加到純化柱柱面中央，使其被完全吸收。如需獲得更高濃度的樣品，可把洗脫液的體積減小至20µl，但洗脫下 來(lái)的RNA量會(huì)相對(duì)減少。室溫較低時(shí)，洗脫液在37ºC預(yù)熱片刻對(duì)得率有所幫助。此外，洗脫后的溶液再次加回到原純化柱再離心 洗脫一次，可提高得率約10-30%；或者在第一次洗脫后使用新的洗脫液再洗脫一次，會(huì)獲得約為第一次洗脫量15-40%的RNA。
