檢測(cè)原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被Flag標(biāo)簽蛋白抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的Flag標(biāo)簽蛋白（Flag-tag）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），計(jì)算樣品濃度。
樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
自備物品
1. 酶標(biāo)儀（450nm）
2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3. 37℃恒溫箱
操作注意事項(xiàng)
1. 試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會(huì)有結(jié)晶，這屬于正常現(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再使用。
2. 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。
3. 濃度為0的S0號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品即可視為陰性對(duì)照或者空白；按照說(shuō)明書(shū)操作時(shí)樣本已經(jīng)稀釋5倍，最終結(jié)果乘以5才是樣本實(shí)際濃度。
4. 嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。
5. 所有液體組分使用前充分搖勻。
試劑盒組成
| 名稱 | 96孔配置 | 48孔配置 | 備注 |
| 微孔酶標(biāo)板 | 12孔×8條 | 12孔×4條 | 無(wú) |
| 標(biāo)準(zhǔn)品 | 0.3mL*6管 | 0.3mL*6管 | 無(wú) |
| 樣本稀釋液 | 6mL | 3mL | 無(wú) |
| 檢測(cè)抗體-HRP | 10mL | 5mL | 無(wú) |
| 20×洗滌緩沖液 | 25mL | 15mL | 按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋 |
| 底物A | 6mL | 3mL | 無(wú) |
| 底物B | 6mL | 3mL | 無(wú) |
| 終止液 | 6mL | 3mL | 無(wú) |
| 封板膜 | 2張 | 2張 | 無(wú) |
| 說(shuō)明書(shū) | 1份 | 1份 | 無(wú) |
| 自封袋 | 1個(gè) | 1個(gè) | 無(wú) |
注：標(biāo)準(zhǔn)品（S0-S5）濃度依次為：0、5、10、20、40、80ng/mL
試劑的準(zhǔn)備
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。
洗板方法
1. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。
2. 自動(dòng)洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。
操作步驟
1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2. 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；
3. 樣本孔先加待測(cè)樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不加。
4. 除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。
6. 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。
結(jié)果判斷
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。
試劑盒性能
1. 準(zhǔn)確性：標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于0.9500。
2. 靈敏度：最低檢測(cè)濃度小于1.0 ng/mL。
3. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
4. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。
5. 貯藏：2-8℃，避光防潮保存。
有效期：6個(gè)月
