注意：正式測定之前選擇 2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

ACP 是一種在酸性環(huán)境下催化蛋白質水解的酶。該酶主要用于酒精發(fā)酵、啤酒釀造、毛皮軟化、果酒澄清、醬油釀造、飼料等。

測定原理：

酸性條件下，ACP 催化酪蛋白水解產生酪氨酸；在堿性條件下，酪氨酸還原磷鉬酸化合物生成鎢藍；鎢藍在 680nm 有特征吸收峰，通過測定其吸光度增加，來計算 ACP 活性。

自備儀器和樣品：

可見分光光度計、水浴鍋、磁力攪拌器、可調式移液槍、1mL玻璃比色皿、1.5 mL EP管和蒸餾水。

試劑組成和配置：

試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 10 mL 蒸餾水溶解。

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前加入 10 mL 試劑一，沸水浴溶解。

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 50 mL 蒸餾水溶解。

試劑五：液體×1 瓶，4℃保存。

標準品：液體×1 支，0.25 μ mol/mL 標準酪氨酸溶液，4℃保存。

粗酶液提�。�

1. 組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約0.1g組織，

加入1mL試劑一）冰浴勻漿，8000g，4℃離心 10min，取上清，即粗酶液。

2. 血清或培養(yǎng)液：直接測定。

3. 細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500萬細胞加入 1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測。

測定操作：

1.分光光度計預熱30min，調節(jié)波長到680 nm，蒸餾水調零。

2.試劑二、試劑三和試劑四置于30℃水浴保溫 30min。

3.對照管：取一支EP管，加入100μL粗酶液，200μL試劑二，混勻后置于30℃水浴保溫10min；加入200μL試劑三，混勻后8000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入 1000μL試劑四，200μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，于680nm測定光吸收，記為 A 對照管。

4.測定管：取一支EP管，加入100μL粗酶液，200μL試劑三，混勻后置于30℃水浴保溫10min；加入200μL試劑二，混勻后8000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入 1000μL試劑四，200μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，于680nm測定光吸收，記為 A 測定管。（注意與空白管不同，先加試劑三，后加試劑二）

5.空白管：取EP管，加入200μL蒸餾水，1000μL試劑四，200μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，于680nm測定光吸收，記為A空白管。

6.標準管：取EP管，加入200μL標準品，1000μL試劑四，200μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min，于680nm 測定光吸收，記為A標準管。

注意：空白管和標準管只需要測定一次。

ACP 活性計算公式：

1. 按照蛋白濃度計算

ACP 活性單位定義：30℃每毫克蛋白每分鐘催化水解產生1nmol 酪氨酸為1個酶活單位。

ACP 活性（nmol/min/mg prot）= C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V1）÷T= 625×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）÷Cpr

C標準品：0.25 μmol/mL 標準酪氨酸溶液；稀釋倍數(shù)：（100+200+200）÷200=2.5；Cpr：粗酶液蛋白質濃度（mg/mL），注意該粗酶液不能直接用于蛋白質含量測定，需要另外測定；建議稱取同樣質量的樣品，加入1mL 蒸餾水勻漿提取離心后，用本公司蛋白質含量測定試劑盒測定；V1：加入反應體系中粗酶液體積（mL），100μL=0.1 mL；T：催化反應時間（min）,10min。

2．按照樣本質量計算

ACP 活性單位定義：30℃每克樣品每分鐘催化水解產生 1 nmol 酪氨酸為1個酶活單位。

ACP 活性（nmol/min/g）=C 標準品×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）×稀釋倍數(shù)÷（W×V1÷V2）÷T=625×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）÷W

C 標準品：0.25 μmol/mL 標準酪氨酸溶液；稀釋倍數(shù)：（100+200+200）÷200=2.5；W：樣品質量（g）；V1：加入反應體系中粗酶液體積（mL），100μL=0.1 mL；V2：粗酶液總體積（mL），

1mL；T：催化反應時間（min），10min。

3. 按照液體體積計算

ACP 活性單位定義：30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產生 1 nmol 酪氨酸為 1 個酶活單位。

ACP 活性（nmol/min /mL）=C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）×稀釋倍數(shù)÷V1÷T= 625×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）

C 標準品：0.25 μ mol/mL 標準酪氨酸溶液；稀釋倍數(shù)：（100+200+200）÷200=2.5；V1：加入反應體系中血清或培養(yǎng)液體積，100μL=0.1 mL；T：催化反應時間，10min。

4. 按照細胞數(shù)量計算

ACP 活性單位定義：30℃每10⁴個細胞每分鐘催化水解產生1 nmol 酪氨酸為1個酶活單位。

ACP 活性（nmol/min/10⁴cell）=C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）×稀釋倍數(shù)÷（細胞數(shù)量×V1÷V2）÷T = 625×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）÷細胞數(shù)量

C 標準品：0.25 μmol/mL 標準酪氨酸溶液；稀釋倍數(shù)：（100+200+200）÷200=2.5；V1：加

入反應體系中粗酶液體積，100μL=0.1 mL；V2：粗酶液總體積，1mL；T：催化反應時間，10min。

注意事項：

臨用前配制的試劑配置好后3天內使用完畢。