注意：正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
土壤亞硝酸還原酶試劑盒可見分光光度法測定意義
土壤亞硝酸還原酶是反硝化作用中的關(guān)鍵酶之一，參與亞硝酸鹽至 NO 的還原反應(yīng)，它的活性反映了生物降解過程中氮素的轉(zhuǎn)化效率，為氮素轉(zhuǎn)化規(guī)律的研究提供一定的依據(jù)。
測定原理
亞硝酸還原酶可將NO2-還原為 NO，使樣品中參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物的NO2-減少，即 540nm處吸光值的變化可反應(yīng)土壤中亞硝酸還原酶的活性。
需自備的儀器和用品
天平、可見分光光度計(jì)、水浴鍋、低溫離心機(jī)、1mL 玻璃比色皿。
試劑的組成和配制
試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 10mL 蒸餾水溶解。
試劑三：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。
試劑四：液體 25mL×1 瓶，4℃避光保存。（使用前50℃加熱溶解）
試劑五：液體 25mL×1 瓶，4℃避光保存。
工作液：臨用前根據(jù)用量將試劑四和試劑五以 1:1 的比例混合。
測定操作表
土樣自然風(fēng)干或35℃烘干
|
| 空白管 | 對照管 | 測定管 |
| 風(fēng)干土樣（g） |
| 0.1 | 0.1 |
| 蒸餾水（μL） |
| 200 |
|
| 試劑一（μL） | 200 |
| 200 |
| 試劑二（μL） | 200 | 200 | 200 |
| 混勻后，25℃反應(yīng) 1h | |||
| 試劑三（μL） | 200 | 200 | 200 |
| 充分震蕩 30S，10000rpm，4℃，離心 10min | |||
| 上清液（μL） | 500 | 500 | 500 |
| 工作液（μL） | 1000 | 1000 | 1000 |
| 充分混勻，室溫靜置顯色10min，用蒸餾水調(diào)零，于1mL玻璃比色皿中測定540nm各管吸光值，分別記為 A 空白管、A 對照管、A 測定管。 | |||
計(jì)算公式
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y =0.0129x - 0.0106，R2 =0.9985
酶活單位定義：每g土樣每24h還原1μmol NO2ˉ的量為一個(gè)酶活力單位。
S-NiR（μmol/d/g）=[A 空白管-(A 測定管-A 對照管)+0.0106]÷0.0129×V 反總÷W÷T
=930.23×[A 空白管-(A 測定管-A 對照管)+0.0106]÷W
V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.5mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1h=1/24d；W：樣本質(zhì)量，g。
注意事項(xiàng)
1、 配制好的試劑二和工作液3天內(nèi)使用完。
2、 若吸光值超過2，將上清液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯笤偌尤牍ぷ饕猴@色，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
3、 嚴(yán)格控制顯色時(shí)間，否則會對結(jié)果有影響。
